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Análise histológica comparativa da indução de calos em genótipos de Coffea
(2005) Barbosa, Wellington Marota; Meira, Renata Maria Strozi Alves; Cordeiro, Antônio Teixeira; Otoni, Wagner Campos; Sakiyama, Ney Sussumu; Embrapa - Café
Neste trabalho foram avaliados os genótipos Catimor (híbrido UFV 395-141) e o cultivar Apoatã (C. canephora). A reação calogênica em explantes foliares de C. canephora cv. Apoatã foi induzida em cultivo unifásico com BAP como regulador de crescimento. Para o genótipo Catimor utilizou-se o sistema bifásico com citocinina e auxina. Foram confeccionadas lâminas de amostras dos explantes foliares que, depois de coletados e fixados foram incluídos em metacrilato, cortados em micrótomo rotativo, corados com azul de toluidina e submetidos aos testes histoquímicos para detecção de polissacarídeos neutros (P.A.S. - "Periodic Acid Schiff") e de proteína (XP - "Xylidine Ponceau"). Sugere-se que as diferenças na resposta dos explantes a diferentes condições indutoras possam ser utilizadas como marcadores estruturais para seleção de cultivos de explantes potencialmente embriogênicos.
Embriogênese somática em cafés arábica e robusta
(Universidade Federal de Viçosa, 2003) Barbosa, Wellington Marota; Sakiyama, Ney Sussumu; Universidade Federal de Viçosa
A indução calogênica em explantes foliares de C. canephora cv. Apoatã foi induzida utilizando-se cultivo unifásico com BAP como regulador de crescimento. Para o genótipo Catimor utilizou-se o sistema bifásico com citocinina e auxina. Foram confeccionadas lâminas de amostras dos explantes foliares que, após coletados e fixados foram incluídos em metacrilato, cortados em micrótomo rotativo, corados com Azul de Toluidina e submetidos aos testes histoquímicos para detecção de amido (P.A.S. - “Periodic Acid Schiff”) e de proteína (XP - “Xylidine Ponceau”). Calos embriogênicos e calos embriogênicos friáveis foram formados apenas no genótipo Apoatã. No genótipo Catimor, cultivado apenas com citocinina, houve a formação de calos embriogênicos, enquanto que naquele cultivado com auxina e citocinina houve a formação de calos mistos. Nos genótipos Catimor UFV 395-141 e Apoatã, cultivados apenas com citocininas, observou-se um dimorfismo nas células que formam o calo - o primeiro com células maiores, vacuolizadas e sem reservas (amido e proteína), e outro formando grupos de células com características meristemáticas, menores, isodiamétricas, com pequenos grânulos de amido, núcleo proeminente e citoplasma denso, com grande quantidade de proteína – denominadas células embriogênicas. Tais células são responsáveis pela formação dos pré-embriões. No genótipo arábica, cultivado em meio com 2,4-D e KIN, observou-se que as divisões celulares foram unidirecionais. As células com características meristemáticas, estavam localizadas apenas nas extremidades do calo, e se apresentaram com tamanhos semelhantes às demais células que formam o calo e não formaram estruturas organizadas em grupos de células, advindas de divisões periclinais e anticlinais. Estas diferenças na resposta dos explantes a diferentes condições indutoras poderiam ser utilizadas como marcadores estruturais para seleção de cepas potencialmente embriogênicas. Foram também testados diferentes meios de cultura para a indução da reação calogênica em explantes foliares dos genótipos Catimor UFV 395-141, H 337-610 e H 447-12, híbridos segregantes oriundos do programa de melhoramento genético da UFV-EPAMIG. Explantes foliares dos híbridos Catimor UFV 395-141 e H 337-610 produziram calos embriogênicos (CE) com o suprimento de 2,4-D e BAP, nos meios primários e secundários, respectivamente; no entanto, com baixa freqüência. O híbrido H 447-12 apresentou CE quando os meios continham 2,4-D e BAP no meio primário, e em maiores freqüências, em relação aos outros genótipos testados. Calos friáveis embriogênicos foram obtidos nos três genótipos utilizando-se citocinina (BAP) no meio primário, acrescentado de auxina (2,4-D) no meio secundário. Culturas líquidas foram estabelecidas e, depois de realizada a indução embriogênica dos agregados celulares, obtiveram-se rendimentos de 148.000 embriões.g-1 para o genótipo Catimor UFV 395-141, 160.000 embriões.g -1 para o híbrido 337-610 e 90.000 embriões.g -1 para o híbrido 447-12. Amostras de embriões somáticos tipo torpedo dos três genótipos foram tomadas para avaliação do desenvolvimento embriogênico, e apresentaram valores, respectivamente de desenvolvimento e formação de raízes, de 89 e 42%, no genótipo Catimor UFV 395-141. Para o híbrido H 337-610, esses valores foram de 83 e 53% e, 66 e 39,3% para o híbrido H 447-12.
Embriogênese somática em híbridos de Coffea arabica para a propagação clonal
(2003) Barbosa, Wellington Marota; Cordeiro, Antônio Teixeira; Cruz, Ana Claudia Ferreira da; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A propagação clonal de cafeeiros, em grande escala, requer a indução de calos friáveis embriogênicos (CFE) para o estabelecimento de culturas líquidas e sua diferenciação embriogênica posterior. Considerando-se que as condições indutoras para a produção de CFE’s possuem, aparentemente, um caráter de genótipo-especificidade, testaram-se diferentes meios de cultura para a indução desta reação calogênica em explantes foliares de três genótipos híbridos segregantes oriundos do programa de melhoramento genético da UFV-EPAMIG. Os genótipos escolhidos foram o híbrido Catimor F 3 UFV 395-141, o híbrido F 1 337- 610, entre Catuaí Vermelho x Híbrido de Timor CIFC 832-1, e o híbrido F 1 447-12, entre Mundo Novo x Híbrido de Timor UFV 337-1. Explantes foliares destes cafeeiros, após desinfeção em solução de hipoclorito de cálcio 5% contendo Tween 20 0,04%, foram distribuídos com o lado adaxial em contato com o meio semi-sólido contido em placas de Petri estéreis. Cada placa recebeu, inicialmente, cinco explantes, sendo o conjunto repetido vinte vezes e mantidos em condições de obscuridade a 25ºC. Os meios de cultura continham sacarose 30 Kg.m -3 , Gelriteä 0,3%, vitaminas de Gamborg combinados com macro e micronutrientes MS ½ força, cisteína 0,272 mol.m -3 e os reguladores de crescimento BAP (B = 0; 0,1; 1; 5; 10 e 20 mmol.m -3 ) e 2,4-D (D = 0; 1 e 10 mmol.m -3 ), que originaram os seguintes tratamentos: B0,1 (BAP 0,1 mmol.m -3 e 2,4-D 0 mmol.m -3 ); B0,1D1; B1; B1D1; B1D10; B5; B5D10; B10; B10D1; B10D10; B20; B20D10 e D10. A barra indica sucessão de dois meios de cultivo, primário e secundário, com o segundo introduzido na primeira repicagem, que ocorreu aos trinta dias do início da indução. As subculturas subseqüentes ocorreram a intervalos variando de 30 a 60 dias entre si. Aos oito meses de pós-indução, calos embriogênicos (CE) foram induzidos em explantes dos três genótipos experimentados. Todavia, as suas condições indutoras confirmaram o caráter de genótipo-especificidade. Assim, as maiores produtividades embriogênicas ocorreram para os genótipos Catimor 395 (45 embriões.explante -1 ) e os híbridos 337 (38 embriões.explante -1 ) e 447 (45 embriões.explante -1 ) quando 2,4-D foi suprido no meio primário e BAP no meio secundário, ambos os reguladores associados apenas no meio secundário e ambos os reguladores associados apenas no meio primário, respectivamente. CFE’s foram induzidos em explantes foliares dos três genótipos. Embora para os híbridos 337 (10%) e 447 (12%) o único tratamento eficaz tenha sido B5/B5D10, explantes de Catimor induziram CFE’s em resposta aos tratamentos B5/ B5D10 e B20D10, nas freqüências de 12 e 7% dos explantes, respectivamente. Estes calos foram utilizados para o estabelecimento de culturas líquidas. Todavia, aqueles CFE’s obtidos em explantes Catimor em resposta ao meio B20D10 oxidaram-se rapidamente em meio líquido com perda do potencial embriogênico. Para todos os genótipos experimentados, os agregados celulares induzidos com B5/B5D10 foram distribuídos e transferidos para meios líquidos contendo B5D10, B5D5 e B5D1. Depois de estabelecidas tais cepas, avaliaram-se seus potenciais embriogênicos em meios contendo sais MS força total (MD 1 ) ou ½ força (MD 2 ). Após oito semanas, a produtividade embriogênica do Catimor foi de 145.000, 140.000, 148.000, 140.000, 120.000 e 80.000 embriões.g -1 de matéria fresca de agregados celulares para as cepas B5D10-MD 1 , B5D10-MD 2 , B5D5-MD 1 , B5D5-MD 2 , B5D1-MD 1 e B5D1-MD 2 , respectivamente. Relativamente ao híbrido 337, as produtividades embriogênicas foram 78.000, 80.000, 160.000, 90.000, 168.000 e 100.000 embriões.g -1 de matéria fresca de agregados celulares para as cepas B5D10-MD 1 , B5D10- MD 2 , B5D5-MD 1 , B5D5-MD 2 , B5D1-MD 1 e B5D1-MD 2 , respectivamente. Já para o híbrido 447, tais produtividades embriogênicas foram de 90.000, 92.000, 16.000 e 40.000 embriões.g -1 de matéria fresca de agregados celulares para as cepas B5D10-MD 1 , B5D10-MD 2 , B5D5-MD 1 e B5D5-MD 2 , respectivamente. A cepa B5D1, independentemente da concentração de macro e microelementos MS, não diferenciou embriões. Amostras de embriões somáticos tipo torpedo dos três genótipos foram tomadas para avaliação do desenvolvimento embriogênico, em curso no momento. Uma segunda avaliação de diferenciação embriogênica das cepas encontra-se em curso, no momento, para verificação do efeito da idade da cepa sobre o seu potencial embriogênico.
Genetic divergence in Conilon coffee revealed by RAPD markers
(Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2009) Ferrão, Maria Amélia Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Ferrão, Romário Gava; Barbosa, Wellington Marota; Souza, Elaine Manelli Riva
This study aimed to evaluate the genetic variability of 49 Coffea canephora clones of the breeding program of the Capixaba Institute of Research, Technical Assistance and Rural Extension (Incaper) based on RAPD markers. Thirty-one primers were used with polymorphism patterns that generated 333 markers, of which 231 (69.4%) were polymorphic. The group of genotypes based on the UPGMA algorithm and Tocher optimization methods detected high divergence in the genotypes. It was found that the component clones of each clone variety recommended by Incaper are distributed in various genetically dissimilar groups, in spite of common phenotypic traits. The relatively wide genetic diversity observed here demonstrates the importance of hybridizations between these germplasms. The RAPD markers efficiently estimated the genetic divergence in the 49 C. canephora genotypes studied.
Manose como fonte de carboidrato na calogênese induzida em explantes foliares de Coffea arabica e de C. canephora
(2003) Barbosa, Wellington Marota; Cordeiro, Antônio Teixeira; Cruz, Ana Claudia Ferreira da; Otoni, Wagner Campos; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Na cultura de tecidos, o carboidrato mais comumente utilizado como fonte de energia e carbono é sacarose. Outros carboidratos podem promover diferentes variações de crescimento, a exemplo de manose, que pode inviabilizar o crescimento celular em espécies como Bixa orellana e Zea mays. Este resultado origina-se da ausência da enzima isomerase da manose-fosfato, que impedindo a metabolização da manose-fosfato, causa efeitos negativos no processo glicolítico e na disponibilidade de ortofosfato. Esta característica pode, entretanto, ser útil para a seleção de regenerantes de tecidos desprovidos da enzima transformados com o gene manose-fosfo- isomerase. Assim, objetivou-se avaliar o efeito de manose na calogênese induzida em explantes foliares de Coffea arabica cv. Catuaí Vermelho IAC H2077-2-5-15 e C. canephora cv. Apoatã IAC LC 2258, que reagem favoravelmente à produção de calos friáveis embriogênicos (CFE) quando o carboidrato utilizado é sacarose. Explantes foliares desinfestados foram cultivados em placas de Petri contendo meios autoclavados constituídos de açúcar 30 Kg.m -3 , vitaminas de Gamborg combinados com macro e micronutrientes MS, cisteína 0,272 mol.m -3 , Gelriteä 0,3%, 2,4-D 4,6 mmol.m -3 e KIN 18,6 mmol.m -3 (NS), com macro e micronutrientes MS, cisteína 0,272 mol.m -3 , ágar 0,8% e BAP 20 mmol.m -3 (A) ou com macro e micronutrientes Yasuda, cisteína 0,165 mol.m -3 e BAP 5 mmol.m -3 (B). O componente açúcar foi suprido nas seguintes combinações sacarose:manose 3:0, 2:1, 1:1, 1:2 e 0:3. O pH foi ajustado para 5,6. As placas foram mantidas no escuro a 25 ± 2ºC. Quatro semanas após o início da indução, todos os explantes foram subculturados para os mesmos meios indutores, à exceção daqueles cultivados no meio NS, que foi modificado nas concentrações de macro e micronutrientes e de KIN, reduzidas à metade e para 4,6 mmol.m -3 , respectivamente, e na substituição da auxina, 2,4-D por ANA 0,54 mmol.m -3 . As renovações posteriores ocorreram a intervalos de quatro ou oito semanas. Após 24 semanas de pós-indução, os explantes de ambos os genótipos cultivados na seqüência NS produziram praticamente calos mistos, independentemente do tipo de açúcar no meio semi-sólido. Calos mistos são formações globulares compactas associadas a formações amorfas de células alongadas e moles ao tato, que se caracterizam por crescimento visivelmente mais rápido. Todavia, quando explantes foliares do arábica Catuaí Vermelho foram cultivados em meio A, a reação calogênica mais freqüente foi a cicatricial em resposta a todas as combinações de sacarose:manose, à exceção de quando a fonte de açúcar foi 100% manose, que induziu também calos embriogênicos em 7% dos explantes, aproximadamente. Relativamente aos explantes foliares do canéfora Apoatã cultivados em meio B, todas as razões sacarose:manose induziram CFE’s. Todavia, as maiores freqüências desta reação calogênica foram induzidas quando ambas as fontes foram utilizadas nos meios indutivos. A combinação das duas fontes duplicou, de maneira geral, as freqüências de CFE’s (60 a 72%) relativamente a apenas sacarose (32%). Os CFE’s obtidos foram utilizados para estabelecer culturas líquidas com vistas a estudos futuros relacionados à influência da razão sacarose:manose na cinética de crescimento e diferenciação embriogênica das cepas.
Variabilidade genética em Coffea canephora com base em marcadores RAPD
(2005) Ferrão, Maria Amélia Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Barbosa, Wellington Marota; Ferrão, Romário Gava; Embrapa - Café
Este estudo teve como objetivo avaliar a variabilidade genética, por meio de marcadores do tipo RAPD, de 49 clones de Coffea canephora do programa de melhoramento do Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (Incaper). Foram utilizados 31 primers que geraram padrões de polimorfismo. O agrupamento dos genótipos, com base no algoritmo UPGMA e no método de otimização de Tocher, mostrou elevada divergência entre os genótipos. Verificou-se que os clones componentes de cada variedade clonal recomendada pelo Incaper encontram-se distribuídos em vários grupos geneticamente dissimilares, apesar de possuírem características fenotipícas em comum. A diversidade genética relativamente ampla observada neste estudo demonstra a importância da realização de hibridações entre estes germoplasmas.