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Expressão do gene Gus em embriões zigóticos e calos embriogênicos de Coffea arabica e C. canephora
(2001) Barros, Érika V. S. A.; Cunha, Welcimar G. da; Teixeira, Joao Batista; Brasileiro, Ana Cristina M.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A metodologia de biolística foi utilizada para a transformação genética de Coffea spp. Foram bombardeados embriões zigóticos de C. arabica e calos embriogênicos de C. arabica e de C. canephora. Embriões da cultivar IAPAR 59 foram testados nos dias 2, 5, 7, 9 e 12 do período de cultivo anterior ao bombardeamento. A expressão transiente foi observada em 30 embriões de cada idade após 48 horas do bombardeamento, através de teste histoquímico com X-glu. Outros 30 embriões foram mantidos em meio seletivo com imazapyr 300 nM por 15 d. O maior número de pontos azuis nas análises transiente e estável da expressão do gene gus foi observado na idade de 12 d. Com base neste resultado, foram testados 700 embriões da cultivar Mundo Novo nas mesmas condições, sendo a expressão estável analisada em brotos emergentes após 60 d. Verificou-se que partes de alguns brotos apresentaram coloração azul, indicando a formação de mosaicos. O material de calos embriogênicos proveniente de folhas de cafeeiro foi bombardeado em meio C contendo 0; 0,25; e 0,5 M de manitol. Observou-se o maior número de pontos azuis na análise transiente de amostras dos calos submetidos a pré-tratamento osmótico, sugerindo que esta etapa possa otimizar a transformação deste material.
Identificação de sequências NBS-RGA de Coffea canephora
(2003) Barros, Érika V. S. A.; Fragoso, Rodrigo R.; Machado, Flávia R.; Bertioli, David; Sá, Maria Fátima Grossi de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
C. arabica é uma espécie altamente susceptível a pestes e doenças. Os nematóides causam danos severos às plantações de café do Brasil. Atualmente, as espécies de Meloidogyne mais agressivas são M. incognita, M. paranaensis e M. exigua. Neste trabalho são descritos os resultados obtidos da amplificação do DNA de um genótipo de C. canephora resistente ao M. paranaensis através de iniciadores degenerados desenhados para se ligarem ao domínio NBS (nucleotide binding site) dos RGAs (resistance genes analogues) em estudo. Os clones positivos foram seqüenciados e os dados resultantes analisados com os programas Blastx, Staden e Clustal. As análises revelaram que foram isoladas seqüências do tipo NBS, conforme esperado. A comparação das sequências traduzidas revelou correlação com os genes de resistência já descritos em diferentes espécies de plantas. As seqüências tipo NBS clonadas serão úteis na busca dos genes completos de C. canephora que possam ser testados para a conferência de resistência aos nematóides em plantas modelo, com a finalidade futura de desenvolver genótipos elite de C. arabica resistentes aos nematóides.
Inibidores de [alfa]-amilase e sua aplicação no controle da broca-do-café
(2007) Barbosa, Aulus Estevão Anjos de Deus; Barros, Érika V. S. A.; Teixeira, Joao Batista; Sá, Maria Fátima Grossi de; Embrapa - Café
O Brasil é o maior produtor mundial de café, detendo 36% do mercado, e as espécies Coffea arabica (65%) e Coffea canephora (35%) são as mais comercializadas. As plantações de café são atacadas por uma série de pragas agrícolas, sendo a principal delas a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Este coleóptero é bastante difícil de ser controlado, pois passa todo o ciclo de vida protegido dentro do fruto do café. O controle é restrito a utilização de inseticida carcinogênico e tóxico para o meio ambiente. Recentemente, foi demonstrando em experimentos in vitro que o inibidor [alfa]-AI1 do feijão Phaseolus vulgaris inibe a atividade das duas [alfa]-amilases presentes no trato intestinal da broca-do-café. Em nosso grupo de trabalho foi demonstrado que um inibidor de [alfa]-amilase presente em acessos do feijão selvagem Phaseolus coccineus ([alfa]IPC) é altamente ativo contra [alfa]-amilases desta praga. A disponibilidade em nosso laboratório destes gene e de técnicas eficientes para transformar geneticamente C. arabica e C. canephora tornaram possível a obtenção de plantas de café transformadas com o gene do inibidor [alfa]-AI1 e de embriões selecionados com o inibidor [alfa]IPC para o controle da broca. Utilizando a técnica de biobalística em calos embriogênicos de C. arabica foram obtidas 6 plantas positivas para o gene [alfa]-AI1, já identificadas via Southern Blot. Estas plantas apresentaram baixo número de cópias, 5 delas com 1 cópia e apenas uma planta com duas cópias do gene. Duas das plantas positivas por Southern Blot estão produzindo frutos e logo será possível avaliar o nível de expressão do inibidor [alfa]-AI1e a atividade dos frutos transgênicos no controle da broca-do-café via bioensaios. Os calos embriogênicos de C. arabica e C. canephora transformados com o inibidor de alfa-amilase do feijão Phaseolus coccineus estão em meio de indução de regenerando embriões dos calos selecionados. O resultado deste trabalho poderá resultar em cultivares de café menos impactantes ao meio ambiente, tornando o café brasileiro mais competitivo no mercado internacional.
Transformação genética de Coffea arabica através de bombardeamento
(2000) Barros, Érika V. S. A.; Araújo, Gisele B.; Brasileiro, Ana Cristina M.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A manipulação genética de espécies de Coffea através de procedimentos de transformação constitui uma valiosa ferramenta para os programas de melhoramento de café. Vários estudos já foram desenvolvidos para o estabelecimento de um protocolo eficiente de transformação de C. arabica. Entretanto, os mais conhecidos, como uso de protoplastos e transformação mediada por Agrobacterium, foram dificultados por problemas de regeneração in vitro. Desta forma, o objetivo deste trabalho é testar o uso da biolística como uma estratégia alternativa para transformação da região do meristema apical de embriões zigóticos de C. arabica. Neste trabalho são apresentados os resultados provenientes de experimentos preliminares de desenvolvimento de um protocolo de transformação via bombardeamento para obtenção de plantas transgênicas de C. arabica. Foram determinadas as condições básicas para a multibrotação in vitro de meristemas apicais de embriões zigóticos de C. arabica e posterior aclimatação dos brotos obtidos. Além disso, são apresentados os resultados comparativos de reguladores de crescimento de plantas em dois cultivares de C. arabica. A dose seletiva de Imazapyr, a molécula de herbicida utilizada como agente seletivo na transformação de células meristemáticas, também foi estabelecida. Em relação à expressão transiente do gene repórter gus, nossos resultados mostraram que não houve diferença entre três plasmídios testados. Por outro lado, uma variação foi observada em relação à idade do embrião no momento do bombardeamento. A expressão estável do gene gus observada em um broto derivado da região apical de embrião zigótico confirmou a possibilidade de monitoramento da transformação neste tipo de tecido.
Transformação genética de Coffea arabica através do bombardeamento de calos embriogênicos e seleção em canamicina
(2003) Cunha, Welcimar Gonçalves da; Barros, Érika V. S. A.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A obtenção de novos cultivares adaptadas às necessidades da produção agrícola é um desafio constante no melhoramento genético do cafeeiro. Nos últimos anos, a criação de técnicas biotecnológicas vem trazendo novas perspectivas para o melhoramento genético do cafeeiro ao permitir a introdução de genes específicos em variedades elite em um espaço de tempo significativamente reduzido. Entretanto, apesar dos vários estudos já desenvolvidos, ainda não foi descrito um protocolo de alta eficiência para a obtenção de plantas transgênicas de C. arabica. Como alternativa aos protocolos já existentes ou em estudo, o presente trabalho tem por objetivo o estabelecimento de um protocolo eficiente para a introdução de transgenes em C. arabica. Neste trabalho são apresentados resultados do bombardeamento de calos embriogênicos e seleção de transformantes em canamicina. Discos foliares de C. arabica variedade Catuaí Vermelho foram cultivados em meio C modificado contendo 20mM de 2,4-D e incubados por 6 meses. A massa de calos embriogênicos formada foi bombardeada 24 h após pré-tratamento osmótico com manitol 0,5 M. Para este procedimento foi utilizado o vetor pBI 426 contendo o gene gus, que codifica a enzima ²-glucuronidase, e o gene nptII que confere resistência a canamicina. A massa de calos bombardeados foi então transferida para o meio C modificado e subcultivada em doses crescentes de canamicina. Os embriões regenerantes em canamicina 400 mg/L foram transferidos para o meio WPM. O teste histoquímico dos calos, embriões ou folhas das plantas regenerantes em meio seletivo revelou a atividade da enzima GUS, indicando assim que a técnica é eficiente para a introdução de transgenes de interesse em C. arabica. As análises moleculares das plantas obtidas estão em andamento para a confirmação da transformação. Desta forma, os resultados obtidos indicam que uma nova e promissora metodologia, visando à introdução de genes de interesse em C. arabica, está sendo estabelecida. De acordo com os trabalhos de biolística em outras culturas, é possível que este método também seja viável para variados genótipos de café.