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Análise do perfil transcriptômico e proteômico de raízes de diferentes clones de Coffea canephora em condições de déficit hídrico
(Universidade Federal de Lavras, 2015-04-30) Costa, Tatiana Santos; Andrade, Alan Carvalho
O café é uma das principais commodities agrícolas do mundo, sendo o Brasil o maior produtor. A seca é um problema frequente no país, uma vez que é considerado um fator limitante que possibilita oscilações na produtividade do cafeeiro. Em resposta ao déficit hídrico as plantas ativam mecanismos que a auxiliam suportar períodos de seca, promovendo alterações na fotossíntese, respiração, translocação, absorção de íons, o metabolismo de nutrientes e hormônios. O presente trabalho tem por objetivo avaliar a expressão diferencial de genes e proteínas em raízes de clones de C. canephora var. Conilon, sendo o clone 22 (sensível à seca) e os clones 14, 73 e 120 (tolerantes à seca), cultivados em condições controladas em condições irrigada e sob estresse hídrico. Para cada clone e regime hídrico foi extraído o RNA total e avaliado o perfil transcriptômico e proteômico das raízes por meio do sequenciamento 454 e da espectrometria LC-MS, respectivamente. Os resultados apresentados possibilitaram uma melhor compreensão de alguns mecanismos de resposta em raízes em clones C. canephora quanto a tolerância ao déficit hídrico, por meio da diferença de expressão gênica e dos nos níveis de proteínas entre as condições avaliadas (I e NI). Foi possível verificar que, entre os clones tolerantes há diferentes mecanismos de respostas ao estresse. O pirossequenciamento 454 permitiu gerar mais de 4 milhões de reads a partir de 08 bibliotecas de raízes de C. canephora provenientes dos clones nas duas condições, o que possibilitou a ampliação dos dados de sequências para este tecido. Vários genes candidatos foram identificados e avaliados quanto à resposta da planta ao déficit hídrico, como em relação a biossíntese do ABA e aos estresses osmóticos e oxidativos. A técnica LC-MS permitiu a identificação de 598 proteínas, o que representa cerca de 1% do proteoma conhecido de C. canephora. Para algumas proteínas foi possível identificar diferentes formas alélicas. De forma geral, a resposta dos clones de C. canephora ao déficit hídrico foi evidenciada neste trabalho. Na maioria dos casos há correspondência entre os resultados das técnicas “Omicas” utilizadas. Entretanto, ainda é necessário o aprimoramento das técnicas para identificação proteica, como por meio da utilização de sequências genótipo-específicas, considerada uma alternativa para futuras análises integradas, possibilitando a compreensão dos mecanismos de regulação e dos pontos de controle do fluxo da informação gênica. Em complemento aos trabalhos anteriores, no qual foram utilizadas folhas, também foi possível identificar vários genes de tolerância à seca em raízes de cafeeiro.
Análise preliminar para integração do perfil genômico e proteômico de raízes de Coffea canephora submetidos a diferentes condições hídricas
(Embrapa Café, 2013) Costa, Tatiana Santos; Melo, Jorge Alex Taquita; Carneiro, Fernanda de Araújo; Vieira, Natália Gomes; Lima, Edriana Araújo de; Rêgo, Érica Cristina da Silva; Bloch Jr., Carlos; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho
O café é uma das principais commodities agrícolas do mundo, sendo o Brasil o maior produtor e o segundo maior consumidor. A seca é o principal fator limitante à produção do café no país. O crescimento das plantas em condições de seca é influenciado por alterações na fotossíntese, respiração, translocação, absorção de íons, o metabolismo de nutrientes e hormônios. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica e proteica em raízes de clones de C. canephora var. Conilon, cultivados em condições controle e sob estresse hídrico. Os clones avaliados foram o clone 22 (sensível à seca) e os clones 14, 73 e 120 (tolerantes à seca), cultivados em condições controladas (casa de vegetação) com (I) e sem (NI) irrigação. Para cada clone e regime hídrico, foi extraído o RNA total. O perfil do transcriptoma das raízes foi realizado utilizando o sequenciamento 454, o que possibilitou análises in silico da expressão por Northern eletrônico entre os clones e comparando as condições I vs. NI. As análises proteômicas foram realizadas por LC-MSE utilizando cromatografia líquida de fase reversa acoplada à espectrometria de massa. Os resultados de identificação proteica foram obtidos com o software “Protein Lynx”. Os resultados obtidos pelas análises integradas de duas dehidrinas CcDH1a e CcDH3 são apresentados. Os resultados mostram que existem diferenças entre as técnicas utilizadas, bem como no comportamento dos clones em relação às condições de estresse. As análises de expressão por qPCR em tempo real foram realizadas para validar os níveis de expressão gênica obtido pelas análises in silico.
Avaliação fenotípica de uma população de Coffea canephora var. conilon cultivada em altitude elevada, visando um programa de Seleção Genômica Ampla (SGA) em cafeeiro
(Embrapa Café, 2013) Carneiro, Fernanda de Araújo; Rêgo, Érica Cristina da Silva; Costa, Tatiana Santos; Oliveira, Sinara de Aquino; Duarte, Karoline Estefani; Rocha, Omar Cruz; Rodrigues, Gustavo Costa; Carvalho, Milene Alves de Figueiredo; Marraccini, Pierre; Grattapaglia, Dario; Bartholo, Gabriel Ferreira; Guerra, Antônio Fernando; Andrade, Alan Carvalho
Considerada a bebida não alcoólica mais popular e regularmente consumida por 40% da população, o café ocupa uma posição de destaque na economia sendo um dos mais importantes produtos de exportação mundial. Sua produção está sujeita a oscilações regulares devido ao ciclo bienal da planta, e também a fatores abióticos, como o estresse hídrico e altas temperaturas. Visando-se o estabelecimento de ferramentas de auxílio para se acelerar o melhoramento genético desta espécie, avanços significativos em genômica do cafeeiro têm ocorrido nos últimos anos. Como exemplo, pode-se citar a recente conclusão do sequenciamento do genoma completo de Coffea canephora, que servirá de referência para utilização em trabalhos avançados de genética molecular, aplicados diretamente ao melhoramento genético desta espécie, tais como o estabelecimento de programas de seleção genômica ampla (SGA) em cafeeiro. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi a caracterização fenotípica de uma população de C. canephora, com cerca de 1300 indivíduos, cultivada em Planaltina-DF (1175m de altitude) no campo experimental da Embrapa Cerrados. As avaliações iniciaram em 2012, observando-se características como vigor, seca de ponteiro, ramificação secundária, presença de ferrugem, precocidade do fruto e carga. Além disso, a produção (em litros – L) de cada planta foi medida ( 2012 e 2013). No ano de 2012, uma amostra 3L de frutos de cada planta selecionada após a colheita, foi despolpada, para realização da classificação, peneira e peso de 100 grãos. O potencial hídrico foliar de antemanhã (am) de uma amostra de plantas também foi avaliado no período de seca dos anos de 2012 e 2013. Os resultados obtidos até o momento, nos permite concluir que existe potencial para o cultivo em condições irrigadas, de C. canephora em altitudes elevadas e que, a população em estudo apresenta diversidade fenotípica adequada para a implementação de um programa de seleção genômica ampla em cafeeiro.
Caracterização molecular e seleção de genes candidatos à resistência do clone 14 de Coffea canephora conilon a Meloidogyne paranaensis
(Embrapa Café, 2015) Lima, Edriana Araújo de; Carneiro, Fernanda de Araújo; Rêgo, Erica Cristina Silva; Costa, Tatiana Santos; Cotta, Michelle Guitton; Jorge Júnior, Aldemiro; Marraccini, Pierre; Carneiro, Regina Maria Dechechi Gomes; Andrade, Alan Carvalho
Os nematoides das galhas estão entre os patógenos mais nocivos para a agricultura cafeeira no Brasil e C. canephora tem se mostrado fonte de resistência a esses patógenos. Com o objetivo de identificar genes candidatos a resistência a M. paranaensis, dois clones de Coffea canephora Conilon previamente identificados como resistente (clone 14) e suscetível (clone 22), inoculados ou não em diferentes tempos com M. paranaensis, tiveram seus RNAs extraídos a partir das raizes, sequenciados, mapeados em genoma de referência de C. canephora e avaliados quantitativamente (expressão in silico) por meio de RNAseq e Excel. Dessa forma, foi possível identificar os genes que mais se expressaram no clone resistente em relação ao clone suscetível, e a respectiva expressão temporal foi relacionada à resistência a M. paranaensis.
Estrutura e diversidade genética de uma população de Coffea canephora conilon utilizando marcadores SNPs identificados por nextRAD
(Embrapa Café, 2015) Carneiro, Fernanda de Araújo; Rêgo, Érica Cristina Silva; Aquino, Sinara Oliveira de; Costa, Tatiana Santos; Lima, Edriana Araújo de; Rocha, Omar Cruz; Rodrigues, Gustavo Costa; Carvalho, Milene Alves de Figueiredo; Marraccini, Pierre; Bartholo, Gabriel Ferreira; Guerra, Antônio Fernando; Silva Jr, Orzenil Bonfim da; Grattapaglia, Dario; Andrade, Alan Carvalho
Dentre as diferentes atividades ligadas ao negócio agrícola em nível mundial, o agronegócio cafeeiro está entre as de maior importância econômica e social, sendo o principal meio de subsistência para mais de 125 milhões de pessoas e produzido em mais de 60 países. A produção cafeeira comercial baseia-se principalmente em duas espécies: Coffea arabica e Coffea canephora. A grande variabilidade genética do C. canephora devido sua alogamia, é um fator de grande importância para os programas de melhoramento do cafeeiro, pois fornece uma fonte de novos genes. O estudo molecular da diversidade genética vem se demonstrando cada vez mais eficiente, necessário e refinado, uma vez que as técnicas moleculares estão evoluindo e os descritores morfológicos estão se tornando insuficientes para a descrição de um indivíduo. Uma ferramenta muito importante no estudo da diversidade genética é o uso dos marcadores moleculares SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), estes consistem na variação de sequência de DNA e podem ser identificados em praticamente todos os genes. No caso de C. canephora, estudos de diversidade podem facilitar a orientação dos programas de melhoramento na escolha de genitores para cruzamentos ou de genótipos para composição de variedades clonais. Este trabalho objetivou (i) avaliar e caracterizar, por meio da técnica de genotipagem nextRAD (Nextera-tagmented reductively-amplified DNA), a diversidade e a estrutura genética de indivíduos de C. canephora Conilon, pertencentes a uma população localizada em campo experimental da Embrapa Cerrados.
Estudo das famílias gênicas CcPYL, CcPP2C e CcSnRK2: componentes centrais na via aba-dependente para a resposta ao déficit hídrico em Coffea canephora
(Embrapa Café, 2015) Cotta, Michelle Guitton; Bocs, Stéphanie; Rego, Erica Cristina Silva; Costa, Tatiana Santos; Aquino, Sinara Oliveira de; Carneiro, Fernanda De Araújo; This, Dominique; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan Carvalho
O déficit hídrico e altas temperaturas são consequências atuais e diretas do aquecimento global e fatores-chave que afetam o desenvolvimento e a produtividade cafeeira. Apesar das complexas estratégias utilizadas por plantas perenes para adaptarem-se à seca, existe no gênero Coffea variabilidade genética que pode ser utilizada como ferramenta para potencializar a tolerância das plantas a esse estresse. O Ácido abscísico (ABA) é o hormônio central que regula a fisiologia da planta na resposta ao déficit hídrico. O objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar os genes componentes do sistema tripartite (PYL-PP2C-SnRK2) de percepção e transdução de sinal de ABA em Coffea canephora. Clones tolerantes (14, 73 e 120) de C. canephora Conilon têm sido caracterizados como plantas vigorosas com alta produtividade durante anos em regime de escassez hídrica e apresentam-se como valiosos modelos de estudo. Receptores intracelulares (PYR/PYL/RCAR) envolvidos na percepção do sinal de ABA foram recentemente identificados em plantas. Um mecanismo de transdução de sinal de ABA foi proposto, envolvendo tais receptores interagindo com fosfatases do tipo PP2C e quinases SnRK2. Neste trabalho, as sequências proteicas de Arabidopsis, citros, arroz, uva, tomate foram escolhidos como query para a busca das respectivas sequências ortólogas de café em bancos de dados. Essa abordagem permitiu identificar 24 genes candidatos (9 PYL/RCAR, 6 PP2Cs e 9 SnRK2) no genoma de C. canephora. Os domínios protéicos específicos de cada família gênica foram verificados nas sequencias aminoacídicas preditas o que permitiu caracterizá-las como receptores (PYR/PYL/RCAR), fosfatases (PP2C) ou quinases (SnRK2) da via de sinalização de ABA. Análises filogenéticas permitiram classificar as sequências polipeptídicas nas subclasses e subfamílias esperadas. As estruturas gênicas (éxons, íntrons e UTRs) foram funcionalmente anotadas no genoma de C. canephora (Coffea Genome Hub: http://coffee-genome.org/). Expressão diferencial foi observada in silico para esses genes nos órgãos (folha, semente, raiz e órgãos florais) de C. canephora. Em condições de déficit hídrico, dados de transcriptoma de raiz mostraram diferentes perfis de expressão entre os clones tolerantes (14, 73 e 120) e o sensível (22). Os resultados de qPCR evidenciaram perfis transcriptômicos diferenciais inclusive entre os clones tolerantes sugerindo a existência de múltiplos mecanismos biológicos para a tolerância à seca por meio da via dependente de ABA no cafeeiro. Outros resultados enfatizaram mecanismos comuns de indução gênica para todos os clones na condição não-irrigada. Tais informações podem ser úteis na identificação do determinismo genético da tolerância à seca no cafeeiro e para obtenção de marcadores moleculares visando auxiliar programas de melhoramento.