Navegando por Autor "Girotto, Larissa"

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Caracterização de promotores de Coffea spp. via transformação genética em planta modelo
(Embrapa Café, 2019-10) Girotto, Larissa; Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryoshi, Caroline; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe Protasio
As mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, e apresentam o potencial de reduzir áreas disponíveis para o plantio de cafeeiros. Diante deste cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre principalmente em resposta a estresses abióticos. Entender a estrutura e composição de sequências gênicas promotoras de cafeeiros é de fundamental importância para compreender melhor os mecanismos genéticos e os processos de regulação da expressão gênica induzidos em períodos de estresse hídrico e salino. Neste estudo identificamos 14 promotores GolS presentes nos genomas de Coffea arabica, C. canephora e C. eugenioides. Dentro das regiões promotoras desses genes, foram observados 12 cis-elementos relacionados a regulação de genes em resposta a condições adversas, dentre eles: ARE, ABRE, MYB e STRE. Após a caracterização in silico dos 14 promotores, o promotor da isoforma de GolS3 (CcGolS3) de Coffea canephora (Cc) foi clonada com o objetivo de verificar o seu comportamento frente a estresses abióticos. Plasmídeos contendo a construção pCcGolS3::GUS (gene repórter da β-glucuronidase) foram inseridos em Arabidopsis thaliana via transformação genética com Agrobacterium tumefaciens. A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A. thaliana transformadas. Para analisar o comportamento deste promotor, as plantas de A. thaliana foram submetidas a estresses hídrico e salino in vitro (0h, 12h, 24h e 48h), os seus respectivos RNAs foram extraídos e a síntese de cDNA foi realizada para a quantificação da atividade transcricional do gene repórter GUS via RT-qPCR. Os nossos resultados indicaram que o promotor de CcGolS3 pode ser caracterizado como do tipo estresse-induzido, visto que o perfil transcricional do gene GUS diretamente proporcional ao tempo de duração dos estresses. O promotor do gene CcGolS3 apresenta um grande potencial para ser utilizado em projetos futuros de melhoramento genético de cafeeiros e obtenção de plantas mais tolerantes a estresses abióticos.
Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína
(Embrapa Café, 2019-10) Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryioshi, Caroline; Girotto, Larissa; Santos, Tiago Benedito dos; Tomaz, Juarez Pires; Pereira, Luiz Filipe Protasio
O café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.
Transcriptoma de C. arabica L. revela diferenças na expressão de genes envolvidos na biossíntese da rafinose
(Embrapa Café, 2019-10) Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Reis Junior, Osvaldo; Domingues, Douglas Silva; Santos, Tiago Benedito dos; Oliveira, Fernanda Freitas de; Girotto, Larissa; Ariyoshi, Caroline; Pot, David; Leroy, Thierry; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Carazzolle, Marcelo Falsarella; Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães; Pereira, Luiz Filipe Protasio
Coffea arabica L. é uma cultura importante em vários países em desenvolvimento. Apesar de sua importância econômica, os dados do transcriptoma mínimo estão disponíveis para tecidos de frutas, especialmente o perisperma, onde vários compostos relacionados à qualidade do café são produzidos. Para compreender os aspectos moleculares relacionados ao desenvolvimento de frutos e grãos de café, relatamos uma análise transcriptoma em larga escala de folhas, flores e frutos. O sequenciamento da Illumina (RNA-seq) resultou em 41.881.572 sequências trimadas com alta qualidade. A montagem de novo gerou 65.364 unigenes com um comprimento médio de 1.264 pb. Um total de 24.548 unigenes foram anotados como genes codificadores de proteínas, dos quais 12.560 sequências eram completas para esta codificação (full lenghts). No processo de anotação, identificamos nove genes candidatos relacionados à biossíntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs). Estes açúcares conferem osmoproteção e são acumulados durante o desenvolvimento inicial dos frutos. Quatro genes dessa via tiveram o seu padrão transcricional validado pela reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Este atlas transcriptômico de C. arabica fornece um importante passo para a identificação de genes candidatos relacionados a diversas vias metabólicas do café, especialmente aquelas relacionadas à composição química dos frutos e a qualidade da bebida. Nossos resultados são o ponto de partida para aumentar o conhecimento sobre as proteínas do café que são produzidas durante os estádios de floração e desenvolvimento inicial dos frutos.