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Análise da estrutura genética da população de Hemileia vastatrix com base no marcador AFLP.
(Universidade Federal de Viçosa, 2009) Maia, Thiago Andrade; Zambolim, Laércio; Universidade Federal de Viçosa
A obtenção de cafeeiros com resistência durável à ferrugem tem sido dificultada pela carência de informação sobre o potencial evolutivo de Hemileia vastatrix. Visando dar subsídios ao programa de melhoramento, a estrutura genética da população de H. vastatrix foi analisada com base no marcador AFLP. Para isso, amostrou-se 91 isolados do fungo em genótipos de Coffea arabica, C. canephora e derivados de Híbrido de Timor e Icatu cultivados nas principais regiões produtoras do Brasil. Após amplificação seletiva usando quatro combinações de primers (EcoRI/MseI), 100 fragmentos polimórficos foram analisados. Cada isolado apresentou um padrão único de alelos AFLP, demonstrando alta diversidade genotípica. A similaridade genética entre os isolados do patógeno variou de 0,08 a 0,70 e nenhuma formação de grupos foi observada no dendrograma. Não houve correlação entre similaridade genética e distância geográfica entre os isolados (r = 0,307, P = 0,234). Os isolados de H. vastatrix foram agrupados com base no hospedeiro em três populações (C. arabica, C. canephora e derivados de Híbrido de Timor/Icatu) e observou-se baixa diferenciação genética (GST = 0,026) entre elas. Após analisar as populações subdivididas com base na região geográfica a diversidade gênica (HT, HS e GST) não variou significativamente entre as populações e com base na AMOVA verificou-se que a variância genética (99,56%) ocorre dentro da população de H. vastatrix. A análise do número de migrantes (Nm) revelou alta taxa de fluxo gênico entre as populações originadas de hospedeiros distintos. Com base no índice de associação, a hipótese de acasalamento aleatório não foi rejeitada (IA = 0,22, P = 0,12) para a população do fungo proveniente de C. canephora. Os resultados apresentados demonstram que a população de H. vastatrix não possui uma estrutura populacional clonal, indicando um alto potencial evolutivo, o que traria implicações diretas no manejo deste patossistema, principalmente na obtenção de variedade com resistência durável.
Diversidade genética de Hemileia vastatrix utilizando marcador molecular AFLP
(2007) Maia, Thiago Andrade; Zambolim, Eunize Maciel; Caixeta, Eveline Teixeira; Missio, Robson Fernando; Zambolim, Laércio; Embrapa - Café
Esse estudo teve como objetivo analisar a diversidade genética de 14 isolados de Hemileia vastatrix utilizando o marcador AFLP. Dentre eles, dois isolados do CIFC, Oeiras, Portugal biologicamente caracterizados como raça II, três do Brasil, caracterizados em 1986, como raça I, II e III, e nove provenientes de lavouras cafeeiras de Minas Gerais e Espírito Santo coletadas em 2006. As amplificações seletivas dos DNAs foram feitas utilizando quatro combinações de oligonucleotídeos iniciadores contendo três bases adicionais na extremidade 3’. As 93 bandas polimórficas analisadas geraram um dendrograma que dividiu os isolados em seis grupos. No grupo I foram agrupados os isolados de Portugal, Brasil (caracterizados como raças em 1986) e um isolado do Triângulo Mineiro, e no grupo II, os isolados da Zona da Mata, Alto Paranaíba e Sul de Minas Gerais. Os demais isolados formaram os grupos individuais III (região central de MG), IV (Zona da Mata, MG), V (Região Serrana, Espírito Santo) e VI (Zona da Mata, MG). A diversidade genética total (Ht) dos isolados agrupados dentro das nove populações definidas pelas origens foi de 0,313 e a diferenciação genética entre populações (Gst) de 0,916. Baseado no agrupamento UPGMA os isolados foram agrupados em seis populações onde a diversidade genética total (Ht) foi de 0,285 e a diferenciação genética entre populações (Gst) de 0,886. Esses resultados indicam que a variabilidade genética de H. vastatrix entre os isolados é bastante elevada e que os isolados provenientes Do campo possuem baixa similaridade genética com as raças caracterizadas em 1986 e a raça II de Portugal. Um estudo mais amplo e detalhado envolvendo outros isolados, mais representativos da população atual no campo será necessário para definir os isolados prevalecentes em cada região.
ESTRUTURA GENÉTICA DA POPULAÇÃO DE Hemileia vastatrix COM BASE NO MARCADOR AFLP
(2009) Maia, Thiago Andrade; Zambolim, Eunize Maciel; Caixeta, Eveline Teixeira; Mizubuti, Eduardo Seiti Gomide; Santana, Mateus Ferreira; Zambolim, Laércio; Embrapa - Café
A estrutura genética populacional de Hemileia vastatrix foi determinada usando o marcador AFLP em 91 isolados coletados em lavouras cafeeiras de Minas Gerais, Espírito Santo e São Paulo. Após amplificações seletivas, usando quatro combinações de primers (EcoRI/MseI), foram analisados 100 fragmentos polimórficos. Cada isolado apresentou um padrão único de alelos AFLP, constatando-se alta diversidade genotípica. A similaridade genética entre os isolados de H. vastatrix variou de 0,08 a 0,70, indicando alta variabilidade genética. Pela análise de agrupamento não foi observado à formação de grupos entre isolados do mesmo hospedeiro e origem geográfica. Não houve correlação entre distância genética e geográfica entre os isolados (r = 0,307, P = 0,234). Foi observada baixa diferenciação genética (GST = 0,026) entre as populações de H. vastatrix divididas por hospedeiros (Coffea arabica, C. canephora e Híbrido de Timor/Icatu). Os índices de diversidade gênica de Nei (HT, HS e GST) não mostraram diferença significativa entre as populações de H. vastatrix subdivididas por região geográfica. A análise de variância molecular (AMOVA) mostrou que a maior variância genética (99,56%) encontra-se dentro das populações do patógeno. O alto nível de diversidade genotípica encontrado entre os isolados sugere que as populações de H. vastatrix analisadas não são consistentes com a reprodução clonal e não estão estruturadas com relação ao hospedeiro e a origem geográfica. Os resultados obtidos demonstram que o fungo apresenta alto potencial evolutivo.
Identificação e análise funcional de efetores de Hemileia vastatrix, agente causal da ferrugem do cafeeiro
(Universidade Federal de Viçosa, 2013-02-27) Maia, Thiago Andrade; Brommonschenke, Sérgio Hermínio
A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix, é o principal problema fitossanitário da cafeicultura, podendo ocasionar perdas da ordem de 35 a 50% da produção se não forem implantadas medidas de controle. Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugens secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Já foram identificados geneticamente pelo menos nove genes dominantes (SH1 a SH9) que conferem resistência à ferrugem do cafeeiro, no entanto, apesar de muitos anos de pesquisa neste patossistema, os genes Avr complementares de H. vastatrix ainda não foram identificados ou caracterizados. Uma abordagem que pode ser realizada com esta finalidade é a análise do transcriptôma e de bioinformática para identificar genes candidatos de H. vastatrix que cumpram uma lista de critérios específicos em banco de dados de sequências, seguida da validação por meio de ensaios funcionais para atividades de efetores. Diante do exposto, os objetivos desse estudo foram: (i) identificar genes de H. vastatrix que codificam proteínas secretadas, expressas durante a germinação dos urediniósporos e também durante a fase biotrófica da interação com o cafeeiro; (ii) expressar genes candidatos a efetores de H. vastatrix, utilizando o sistema armadilha de secreção em levedura YST (Yeast Secretion Trap) para confirmação biológica da predição de secreção realizada por ferramentas de bioinformática; (iii) analisar a estrutura genômica dos genes candidatos a efetores selecionados; (iv) efetuar a análise da expressão temporal dos genes identificados durante as diferentes fases da patogênese; (v) estabelecer um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, com base no Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae. Inicialmente, caracterizou-se o secretoma de urediniósporos germinados de H. vastatrix por meio da construção de uma biblioteca de cDNA a partir de mRNA isolado de urediniósporos germinados in vitro por 16 horas. Após análises das sequências por ferramentas de bioinformática, foram selecionadas 146 ORFs que codificam proteínas secretadas. Durante a anotação dessas sequências constatou-se que 20% do secretoma de urediniósporos germinados são constituídos por enzimas hidrolíticas e que a maioria (67%) das proteínas secretadas identificadas possui função desconhecida. A partir dessas sequências foram selecionadas 35 ORFs completas que codificam proteínas com características comuns aos efetores de fungos filamentosos, denominados genes candidatos a efetores de H. vastatrix (HvECs – H. vastatrix effector candidates). Desses, 22 HvECs tiveram suas sequências genômicas caracterizadas, confirmando as ORFs preditas por bioinformática. A secreção de oito HvECs selecionados foi comprovada em levedura, e sua expressão diferenciada, que possivelmente ocorre com as mudanças morfológicas do desenvolvimento do patógeno nos estágios inicias de infecção, foi comprovada por meio RT-qPCR. Posteriormente, caracterizou-se o secretoma de H. vastatrix expresso durante uma interação compatível com o cafeeiro, por meio da combinação de sequenciamento Sanger e pirossequenciamento 454. Esta abordagem integrada permitiu o sequenciamento massivo de um substancial número de etiquetas de sequências expressas (ESTs) em folhas de café infectadas com H. vastatrix, amostradas em quatro tempos diferentes durante a fase biotrófica da interação: 48 horas, 72 horas, 9 dias e 12 dias após a inoculação. Após análises de bioinformática foram selecionados 75 genes e as análises de RT-PCR confirmaram a origem fúngica de 62 genes HvECs. Desses, 22 HvECs são preferencialmente expressos durante a interação com o cafeeiro, apresentando padrões distintos de expressão durante a fase biotrófica da interação. Adicionalmente, desenvolveu-se um protocolo de expressão transiente de proteínas secretadas de H. vastatrix em folhas de cafeeiro, por meio do sistema pEDV e do Sistema de Secreção Tipo III de P. syrigae pv. garcae. A expressão transiente do gene HvEC-016 no citoplasma de cafeeiros resistentes à ferrugem, portadores do gene SH1, desencadeou uma resposta de defesa das plantas, indicando que pode ter ocorrido o reconhecimento da proteína efetora HvEC-016 mediada pela proteína R codificada pelo gene SH1. Esse sistema de expressão transiente e o catálogo de genes candidatos a efetores de H. vastatrix expressos tanto durante a germinação dos urediniósporos como na interação com o cafeeiro, disponibilizados por esse estudo, constituem uma importante plataforma para a identificação de outros genes de avirulência de Hemileia vastatrix.