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Análise da expressão dos genes da subfamília DREB em resposta à seca em plantas de Coffea canephora Conilon
(Universidade Federal de Lavras, 2016-03-30) Reichel, Tharyn; Marraccini, Pierre Roger René
Coffea canephora é uma das espécies de cafeeiro mais importantes economicamente e no Brasil, Conilon é a planta mais amplamente cultivada dessa espécie. Estresses abióticos como as variações de temperatura e períodos de seca são fatores que afetam significativamente a sua produção e tendem a se agravar com as mudanças climáticas reconhecidas mundialmente. Na tentativa de compreender as respostas moleculares do cafeeiro em condições de déficit hídrico, recentes estudos identificaram genes candidatos (GCs), como CcDREB1D. Este gene apresentou maior expressão em resposta à seca nas folhas do clone 14 (tolerante à seca) em relação ao clone 22 (sensível à seca) de C. canephora Conilon. Baseado nesses resultados, na identificação dos genes DREB e seus subgrupos (SGs) de C. canephora, objetiva-se analisar a expressão in silico e também in vivo desses genes de C. canephora nas folhas e raízes de clones tolerantes (14, 73 e 120) e sensível (22) de C. canephora Conilon submetidas ou não a um déficit hídrico. As expressões in sílico de todos os genes DREB foram analisadas a partir do Banco de Dados Coffee Genome Hub e a expressão in vivo foi realizada pela técnica "reverse transcription- quantitative PCR" (RT-qPCR). Nas análises de expressão gênica in sílico foi possível identificar genes DREB com potenciais respostas aos estresses abióticos, corroborando com alguns resultados validados in vivo. Nesta análise, diversos genes mostraram expressão diferencial em resposta à seca entre os SGs (I-IV), os clones tolerantes e sensível e as folhas e raízes. Esses genes com expressão diferencial foram identificados como potenciais GCs e entre eles, verificou-se que a maioria dos clones tolerantes apresentou maior expressão em relação ao sensível em resposta à seca, com os maiores níveis de expressão para os clones 14 e 73. Esses maiores níveis foram observados em folhas quando comparado com as raízes e o SG-I se destacou pelo maior número de genes expressos em resposta à seca. Esses resultados sugerem que os GCs DREB, como Cc05_g06840, Cc02_g03420 e Cc08_g13960, desempenham um papel importante nos mecanismos regulatórios de resposta à seca em C. canephora Conilon.
Estudo da expressão e análise de polimorfismos de genes candidatos para a tolerância à seca em cafeeiro
(Universidade Federal de Lavras, 2010-08-31) Freire, Luciana Pereira; Marraccini, Pierre Roger René
O cafeeiro é uma planta perene, pertencente à família Rubiaceae e ao gênero Coffea. Entre as espécies cultivadas, Coffea canephora (Robusta) e Coffea arabica (Arabica) são as mais importantes economicamente, representando respectivamente 30% e 70% da produção comercial mundial. O déficit hídrico afeta a cultura do cafeeiro podendo resultar em importantes conseqüências sociais (deslocamento de trabalhadores), econômicas e ecológicas. Estudos na área de melhoramento do café têm visado à introdução de novos caracteres para a obtenção de híbridos mais tolerantes à seca. Em nível molecular, existem projetos para se identificar genes candidatos (GC) para a tolerância à seca, seja por meio de estudos da expressão gênica (transcriptoma) ou de proteínas (proteômica). Assim, o primeiro objetivo desse trabalho consistiu em estudar a expressão de GCs (DREB, NAC-R26, RD29, GC10, CCoAMT, OEC, CA, M6FR, as isoformas RBCS1-A e B do gene RBCS), utilizando-se vários cultivares de C. arabica cultivados em campo sob situações diversas de estresse hídrico, por meio da técnica de PCR em tempo real (qPCR). Os GCs utilizados foram previamente identificados e validados, em experimentos com cultivares de C. canephora cultivados em casa de vegetação. O segundo objetivo consistiu em analisar a diversidade nucleotídica in vivo de alguns GCs (DREB, RD29 e NAC-RD26), identificando-se SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), em várias espécies, clones e cultivares de café para tentar relacionar a ocorrência de SNPs com o fenótipo. Para a busca de SNPs , DNA genômico (gDNA) dessas diferentes plantas foram amplificados com dois primers específicos para cada GC utilizado. Os primeiros primers contêm nas extremidades adaptadores M13For ou M13Rev, os quais permitiram avaliar a presença de SNPs, por meio do seqüenciamento dos produtos de PCR sem a clonagem. Para se identificar as formas alélicas presentes em cada genoma, primers (sem adaptadores) foram usados para se amplificar, clonar e seqüenciar as mesmas porções de gDNA. Para o sequenciamento, foram utilizados 10 clones independentes, visando-se a identificação do máximo possível de alelos. As seqüências resultantes foram alinhadas, pelo emprego de aplicativos computacionais visando-se a identificação de regiões polimórficas.