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Análise de splicing alternativo durante o processo de amadurecimento de frutos: aplicação em café e tomate
(Universidade Federal de Minas Gerais, 2023-08-25) Fernandes, Miquéias; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Moura, Eveline Teixeira Caixeta
Alternative Splicing (AS) is a co-transcriptional mechanism that enables the eukaryote to extend its proteome even with a limited number of genes. The cellular machinery performs AS by combining alternative regions of the isoforms in both productive and non-productive transcripts. AS events can be predicted using RNASeq data. In plants, the most frequent event is the retention of introns (IR) that can have a regulatory effect, for example, inserting a premature stop codon (PTC) that leads to degradation of the transcript through the nonsense-mediated decay (NMD) pathway. To study potential AS events in the biological process of coffee bean and tomato ripening, we conducted a DAS study using RNASeq data obtained for differential expression experiment and the referential coffee genome to identify differential AS (DAS). For this, we developed pipelines in Python to perform an automated curation of the 202 target genes that were identified with 241 DAS events by rMATS in the comparisons of early green fruits, intermediate yellow and final red ripening stage. We then carried out a manual curation of the 241 events enriched with the Interproscan5 annotation with further experimentally validating of Potassium channel AKT1 and Apyrase 7 genes under differential alternative expression during coffee grain ripening using conventional PCR and qPCR. Due to challenges identified during this analysis associated with the relationship of AS events and RNASeq data processing, we built an application of user- friendly APP to predict AS in RNASeq data. The application development is composed of three modules named GeneAPPScript, GeneAPPServer, GeneAPPExplorer. The GeneAPPScript module is a powerful wrapper that enables to perform a complete DAS analysis from obtaining network data to functional annotation of genes under DAS. This module can run on Debian distros, such as the Google Collaboratory (Colab) environment where it was developed. The GeneAPPServer module is a Flask backend that allows you to integrate outputs from different DAS analysis software that generate data in tabular outputs. Using GeneAPPExplorer, the user can generate dozens of graphs to graphically visualize important results implicit in technical tables exported by DAS analysis software. In addition, through the webapp, the researcher has access to tables enriched with functional and structural annotation data and event attributes. GeneAPP will contribute to the analysis of AS in several other works deposited in public databases where only differential expression at the gene level was analyzed, allowing further explanation when exploring the transcriptome at the isoform level.
Caracterização de uma região genômica do híbrido de timor CIFC 832/2 associada à resistência à Hemileia vastatrix
(Universidade Federal de Viçosa, 2019-07-31) Alves, Danúbia Rodrigues; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Almeida, Dênia Pires de
A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix é a principal doença de importância econômica dessa cultura, sendo responsável por grandes prejuízos à cafeicultura mundial. Novas raças do patógeno têm surgido infectando cultivares de café comercializados como resistentes a essa doença. Desse modo, devido ao alto potencial adaptativo do fungo, a busca por cafeeiros resistentes a essa doença é uma atividade recorrente nos programas de melhoramento. Estudos com o Híbrido de Timor (HdT), tem sido realizados em pesquisas que visam resistência durável à ferrugem e outras doenças do cafeeiro. Compreender a natureza da resistência duradoura em genótipos do HdT e descrever os genes envolvidos na defesa das plantas é fundamental para o uso eficiente dos recursos disponíveis nesse híbrido natural. A utilização de ferramentas moleculares e de bioinformática tem mostrado resultados significativos para a ampliação do conhecimento dos genes envolvidos no patossistema Coffea - H. vastatrix. Desse modo, objetivou-se com esse estudo sequenciar e caracterizar, por meio de análises de bioinformática, uma região do genoma do Híbrido de Timor CIFC 832/2, que contém marcadores associados à resistência à H. vastatrix. Para isso foi realizado o sequenciamento do clone BAC 70-22F contendo a marca funcional de resistência, por meio da Plataforma Illumina MiSeq (paired – end reads). Posteriormente foi feita a montagem dos contigs e a predição dos genes. Realizou-se a anotação gênica com base nos genomas de Coffea arabica, Coffea canephora e Coffea eugenioides, utilizando a ferramenta BLAST. A anotação gênica revelou a presença de genes candidatos relacionados ao mecanismo de resistência de hospedeiros contra patógenos. Foram anotados 991 genes do clone BAC 70-22F. Desses genes, 340 foram anotados com similaridade com o genoma de C. arabica (var. Caturra), 337 com o genoma de C. eugenioides e 314 com o genoma de C. canephora (clone IF 200). Com base na anotação gênica foram selecionadas duas sequências de genes candidatos a receptores like kinases (RLK) e desenhados primers para estudo do perfil de expressão gênica durante a interação Coffea - H. vastatrix. Um possível gene de resistência, LRR receptor-like serine/threonine-protein kinase GSO2, foi descrito e apresentou um perfil de expressão correspondente a uma resposta de resistência pré-haustorial. O outro possível receptor like kinase em estudo, apresentando um domínio LRR, exibiu uma diminuição na expressão gênica pré-haustorial em genótipos incompatíveis. As análises filogenéticas desses genes, bem como os estudos de identidade e similaridade genética da região genômica clonada, demonstraram uma relação mais próxima entre o clone BAC 70-22F e a espécie C. arabica e corroboram com a diversidade genética descrita para o HdT. Os resultados sugerem que a região genômica clonada do HdT CIFC 832/2 possui importantes genes candidatos a resistência do cafeeiro à H. vastatrix e apresentam informações relevantes para ampliar o conhecimento sobre o HdT, podendo contribuir para futuros planejamentos de estratégias de melhoramento do cafeeiro.
Genomic identification, gene expression and enzyme activity of CAZymes from biotrophic fungus Hemileia vastatrix during coffee leaf infection
(Universidade Federal de Minas Gerais, 2021-02-25) Pereira, Júlia Santos; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
Coffee leaf rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, is a major disease that affects many coffee producers around the world, causing a huge economic loss. H. vastatrix is a biotrophic fungus, hence, its growth and reproduction are totally dependent on the cells of the living host. Because of that, they infect the tissue without causing necrosis. Nevertheless, it is known that some fungi during plant interaction can express genes involved in the formation of infectious structures, as well as synthesize enzymes responsible for the degradation of the host cell wall. However, little is known about the importance of cell wall degrading enzymes (CWDE) for biotrophic phytopathogens. In this work, we performed genomic analysis to identify CAZymes (Carbohydrate Active EnZymes) from H. vastatrix and the analysis of expression and enzyme activity during experimental coffee infection. The first step was the ab initio prediction of H. vastatrix genome, using AUGUSTUS program, which was adjusted with H. vastatrix RNA-Seq for model determination. Functional annotation to identify CAZymes was performed using dbCAN2 meta server. Among the 345 CAZymes found, 162 belong to Glycoside Hydrolases (GH) including 34 endoglucanases, xylanases and polygalacturonases from families GH 5, 9, 10, 12 and 28 - which may act during fungal infection degrading the highest prevalent components of cell wall, represented by cellulose, xylan and pectin, respectively. Physico-chemical parameters of these enzymes were checked, including identification of catalytic residues and standard CAZymes motifs. The enzyme structures were also modelled. Moreover, analysis of expression of enzymes were performed using RNA-seq data from a genotype of C. arabica susceptible to infection, therefore presenting compatible interaction with the pathogen, after 0, 12, 24 and 96 hours after inoculation (hai). Enzyme activity assays were carried out in order to verify if these enzymes were also active during the fungal infection. The enzymes showed typical physico-chemical characteristics and structures of active enzymes including conservation of the catalytic sites. Genes encoding endoglucanases and xylanases were expressed during different times of H. vastatrix infection, being the first more expressed at 12 hai and the other at 24 hai. In agreement with expression data, endoglucanases started to be produced early, and were more active at 24 hai, whereas xylanases had greater activity at 96 hai. The results suggest that biotrophic fungus also use active enzymes on carbohydrates during the infection. In relation to H. vastatrix, these enzymes start being produced at the pre-haustorial phase of the fungal infection, but are more active at the post-haustorial phase, when the haustorium begins to be formed in the host membranes and in the plant cell wall.
Modelagem do metabolismo do café durante a infecção por Hemileia vastatrix em plantas susceptíveis e resistentes
(Universidade Federal de Viçosa, 2018-07-13) Gazolla, Lizandra Cristina de Oliveira Figueiredo; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Caixeta, Eveline Teixeira
O Brasil é o país com a maior produção e exportação de café e as espécies mais cultivadas mundialmente são o Coffea arabica e o Coffea canephora. A doença do cafeeiro de maior relevância no cenário mundial é a ferrugem alaranjada, causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. O principal sintoma é o aparecimento de manchas amareladas na parte abaxial das folhas e, em condições climáticas favoráveis, as perdas na lavoura podem chegar a 50% da produção. O cultivar Híbrido de Timor CIFC 832/2 tem sido uma importante fonte de genes de resistência para os programas de melhoramento. Entretanto, o alto potencial adaptativo do fungo e a própria pressão seletiva causada pela utilização de cultivares resistentes vem culminando no surgimento de diversas raças fisiológicas do fungo capazes de suplantar a resistência obtida através dos métodos clássicos de melhoramento. Uma nova abordagem no estudo da relação parasito-hospedeiro é a integração de dados de genômica e outras ômicas para a construção de um modelo metabólico. Através da análise de balanço do fluxo (FBA) é possível simular o papel de cada gene na célula auxiliando na compreensão da interação entre o cafeeiro e o fungo. Com isto, o presente trabalho propôs a construção de um modelo metabólico baseado no genoma seguido da análise de FBA para cultivares resistente e susceptível após a infecção por H. vastatrix. Os dados de transcriptomica foram integrados ao modelo original gerando modelos contexto- específicos. Essas análises indicaram um acúmulo de glicerol-3-fosfato (G3P) no Hibrido de Timor CIFC 832/2 sugerindo que o metabolismo primário contribui para a resistência do cafeeiro, uma vez que a participação deste metabólito na resposta imune adquirida de plantas já foi demonstrada.
Produção de bioplástico a partir de resíduos de café e seu uso como matriz de liberação de antimicrobianos
(Embrapa Café, 2019-10) Paulino, Graziela dos Santos; Pereira, Júlia Santos; Ribon, Andréa de Oliveira Barros; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
Cada vez mais tem-se buscado desenvolver produtos sustentáveis, dada a grande preocupação com a disposição de rejeitos no meio ambiente. O objetivo desse trabalho foi desenvolver um bioplástico de amido reforçado com microfibras de celulose extraídas do café e incorporado com ampicilina, para avaliação do mesmo como matriz de liberação de ampicilina. Para a fabricação do bioplástico, utilizou-se uma mistura de frutos cereja, boia e verde e o antibiótico testado para liberação controlada foi a ampicilina. Foram utilizados dois protocolos diferentes para a extração das microfibras de celulose, os resultados preliminares mostraram que o protocolo 1 foi mais eficiente. Além disso, todos os biofilmes foram capazes de liberar ampicilina, resultando na inibição do crescimento de Escherichia Coli BL21 em placa. Em estudos futuros pretende-se obter nanocelulose a partir da hidrólise ácida das microfibras para a criação de um bioplástico de celulose pura, que posteriormente será funcionalizado para aplicação na indústria de alimentos.
Receptor-Like Kinase (RLK) as a candidate gene conferring resistance to Hemileia vastatrix in coffee
(Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", 2021) Almeida, Dênia Pires de; Castro, Isabel Samila Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Alves, Danúbia Rodrigues; Barka, Geleta Dugassa; Barreiros, Pedro Ricardo Rossi Marques; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline Teixeira
The biotrophic fungus Hemileia vastatrix causes coffee leaf rust (CLR), one of the most devastating diseases in Coffea arabica. Coffee, like other plants, has developed effective mechanisms to recognize and respond to infections caused by pathogens. Plant resistance gene analogs (RGAs) have been identified in certain plants as candidates for resistance (R) genes or membrane receptors that activate the R genes. The RGAs identified in different plants possess conserved domains that play specific roles in the fight against pathogens. Despite the importance of RGAs, in coffee plants these genes and other molecular mechanisms of disease resistance are still unknown. This study aimed to sequence and characterize candidate genes from coffee plants with the potential for involvement in resistance to H. vastatrix. Sequencing was performed based on a library of bacterial artificial chromosomes (BAC) of the coffee clone ‘Híbrido de Timor’ (HdT) CIFC 832/2 and screened using a functional marker. Two RGAs, HdT_ LRR_RLK1 and HdT_LRR_RLK2, containing the motif of leucine-rich repeat-like kinase (LRR-RLK) were identified. Based on the presence or absence of the HdT_LRR_RLK2 RGA in a number of differential coffee clones containing different combinations of the rust resistance gene, these RGAs did not correspond to any resistance gene already characterized (SH1-9). These genes were also analyzed using qPCR and demonstrated a major expression peak at 24 h after inoculation in both the compatible and incompatible interactions between coffee and H. vastatrix. These results are valuable information for breeding programs aimed at developing CLR-resistant cultivars, in addition to enabling a better understanding of the interactions between coffee and H. vastatrix.
Regulação transcricional do metabolismo de glicerol-3-fosfato induz resistência à ferrugem do café
(Embrapa Café, 2019-10) Gazolla, Lizandra Cristina de Oliveira Figueiredo; Almeida, Dênia Pires; Castro, Isabel Samila Lima; Castro, Alex Gazolla de; Arruda, Luiz Vinícius de Souza; Vieira, Nívea Maria; Mantovani, Hilário Cuquetto; Zambolim, Laércio; Caixeta, Eveline Teixeira; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira
A produção mundial de café tem sido profundamente afetada pela ferrugem do cafeeiro, doença causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Apesar do Híbrido de Timor 832/2, um híbrido natural de Coffea arabica e C. canephora resistente à ferrugem, ser uma importante fonte de genes para programas de melhoramento genético, o mecanismo associado à resistência incluindo a regulação do metabolismo durante a infecção é pouco conhecido. Reconstruímos o primeiro modelo metabólico em escala genômica (GEM) para café e a análise do balanço de fluxo (FBA), após a integração de dados de transcriptômica, sugeriu o acúmulo de glicerol-3-fosfato (G3P) na via glicolítica do Híbrido de Timor. A quantificação de G3P nos cultivares em estudo confirmou o acúmulo previsto. O tratamento de plantas suscetíveis com glicerol 3% antes da inoculação do fungo aumentou a concentração de G3P e reduziu os sintomas da doença. Esses resultados destacam o G3P e o metabolismo primário de carboidratos como importante via de resistência à ferrugem do cafeeiro.