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Análise histológica comparativa da indução de calos em genótipos de Coffea
(2005) Barbosa, Wellington Marota; Meira, Renata Maria Strozi Alves; Cordeiro, Antônio Teixeira; Otoni, Wagner Campos; Sakiyama, Ney Sussumu; Embrapa - Café
Neste trabalho foram avaliados os genótipos Catimor (híbrido UFV 395-141) e o cultivar Apoatã (C. canephora). A reação calogênica em explantes foliares de C. canephora cv. Apoatã foi induzida em cultivo unifásico com BAP como regulador de crescimento. Para o genótipo Catimor utilizou-se o sistema bifásico com citocinina e auxina. Foram confeccionadas lâminas de amostras dos explantes foliares que, depois de coletados e fixados foram incluídos em metacrilato, cortados em micrótomo rotativo, corados com azul de toluidina e submetidos aos testes histoquímicos para detecção de polissacarídeos neutros (P.A.S. - "Periodic Acid Schiff") e de proteína (XP - "Xylidine Ponceau"). Sugere-se que as diferenças na resposta dos explantes a diferentes condições indutoras possam ser utilizadas como marcadores estruturais para seleção de cultivos de explantes potencialmente embriogênicos.
Calogênese em Coffea via cultura semi-sólida
(2000) Santos, Aparecida Célia Paula dos; Cordeiro, Antônio Teixeira; Campos, Maria Rita de Cássia; Otoni, Wagner Campos; Zambolim, Laércio; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O conhecimento das condições genótipo-específicas para as calogêneses embriogênica e friável embriogênica em genótipos de Coffea de interesse é de suma importância para as propagações in vitro em grande escala. Para tanto, submeteram-se explantes foliares dos híbridos interespecíficos Catimor e Cavimor, do canéfora Apoatã e do arábica Catuaí Vermelho a diferentes meios de cultura supostamente indutores de calos. À exceção do Cavimor, todos os genótipos estudados responderam favoravelmente à calogênese primária tipo embriogênica, aos quatro meses de cultura. Aos sete meses de pós-indução, enquanto explantes foliares de Apoatã expressavam calos embriogênicos em todos os meios, aqueles de Catuaí os expressaram praticamente quando a razão auxina/citocinina (1/5) foi mantida constante nos meios de indução e de diferenciação. Esta mesma combinação de meios induziu a maior freqüência de calos friáveis embriogênicos em explantes de Apoatã. O rendimento embriogênico foi maior em calos de Apoatã relativamente àqueles de Catuaí Vermelho.
Embriogênese somática indireta em genótipos de Coffea arabica e de C. canephora
(Universidade Federal de Viçosa, 2002) Santos, Aparecida Célia Paula dos; Otoni, Wagner Campos; Universidade Federal de Viçosa
Explantes foliares dos canéforas Apoatã e Clone 100, dos arábicas Catuaí Vermelho, Catimor UFV 395-141 e dos híbridos 337 (Catuaí Vermelho X Híbrido de Timor) e 447 (Mundo Novo X Híbrido de Timor) foram utilizados para obtenção de calos embriogênicos friáveis em oito meios de cultura: A (BAP 20 µM), B (BAP 5 µM), C (2iP 5 µM), D1 (2,4-D 4,5 µM e Kin 18,6 µM), D2 (ANA 0,54 µM e Kin 4,6 µM), E1 (2,4-D 1,5 µM e BAP 7,5 µM), E2 (2iP 25 µM e AIB 5 µM) e E3 (BAP 5 µM), relativos aos tratamentos A, Aag, A/B, B, C, D1/D2, E1/E2 e E1/E3. Os calos embriogênicos friáveis obtidos foram utilizados para o estabelecimento de culturas líquidas em Erlenmeyers contendo o mesmo meio de sua origem, porém sem Gelrite TM. A densidade inicial foi mantida em 10 g L-1 de meio, sendo as suspensões celulares subcultivadas a intervalos de 14 dias. Para diferenciação de agregados celulares e embriões, a biomassa na densidade de 1 g L-1 foi transferida para os meios de diferenciação. Amostras de calos obtidos em cultura semi-sólida e agregados celulares de culturas líquidas foram coletadas e fixadas em FAA50, por 24 horas, e armazenadas em etanol 70%, com os objetivos de caracterizar, histologicamente, os tipos de calos existentes e diferenciar, em nível celular, as culturas líquidas embriogênicas daquelas não-embriogênicas. As amostras foram incluídas em historesina glicolmetacrilato (HISTORESIN, LEICA) e os blocos, cortados em micrótomo rotativo com 5 µM de espessura. Os cortes foram corados com Azul de Toluidina, P.A.S. e Xylidine Ponceau e as lâminas, montadas com resina Permount. Aos cinco meses pós-cultivo, o canéfora Clone 100 apresentou calo embriogênico friável em todos os meios utilizados, exceto na seqüência D1D2. Aos sete meses pós-cultivo, os genótipos canéforas produziam calos embriogênicos friáveis em quase todos os meios testados, enquanto o Catuaí Vermelho só o fez aos 10 meses no meio Aag1, que continha como agente gelificante ágar em vez de Gelrite TM, como nos outros meios utilizados. Aos 10 meses, todos os meios utilizados para o genótipo Apoatã haviam apresentado calo embriogênico friável em diferentes proporções. Os demais genótipos não apresentaram reação favorável aos meios de cultura utilizados. O estudo da cinética de crescimento das suspensões celulares revelou, imediatamente após a subcultura, uma fase exponencial de crescimento celular até um ponto de inflexão (ti), a partir do qual as taxas de crescimento reduziram progressivamente para atingir um peso de matéria fresca de agregados celulares assintótico. Os ti's das culturas líquidas de Apoatã, Clone 100 e Catuaí Vermelho foram 14, 11 e 10 dias, respectivamente. A diferenciação embriogênica de agregados celulares de Apoatã, em cultura líquida, rendeu cerca de 55.000 embriões g-1 de matéria fresca. O calo iniciou-se com a proliferação das células perivasculares nos genótipos canéforas e também no parênquima clorofiliano no arábica Catuaí. As células do calo possuíam dois padrões de divisão: o primeiro, unidirecional, dava origem a células que se tomavam vacuolizadas e, posteriormente, degeneravam; no segundo, as células se dividiam em três dimensões, originando as células embriogênicas. Nas culturas líquidas de manutenção, observaram-se agregados celulares contendo células meristemáticas de núcleo grande com nucléolo proeminente e citoplasma denso. Nas culturas de diferenciação embriogênica, os agregados celulares formavam nódulos periféricos, de onde se diferenciavam células embriônicas, as quais se dividiam intensamente, formando o embrião. As culturas do Catuaí e Clone 100 podem ser consideradas embriogênicas, pois possuíam embriões globulares, apesar de não terem completado seu desenvolvimento normalmente. As células do genótipo Catuaí apresentaram depósitos de proteínas tanto na cultura de manutenção quanto na cultura de diferenciação. A presença de amido de reserva foi bem maior nas culturas de diferenciaçi4o em relação às de manutenção, em todos os genótipos analisados.
Manose como fonte de carboidrato na calogênese induzida em explantes foliares de Coffea arabica e de C. canephora
(2003) Barbosa, Wellington Marota; Cordeiro, Antônio Teixeira; Cruz, Ana Claudia Ferreira da; Otoni, Wagner Campos; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Na cultura de tecidos, o carboidrato mais comumente utilizado como fonte de energia e carbono é sacarose. Outros carboidratos podem promover diferentes variações de crescimento, a exemplo de manose, que pode inviabilizar o crescimento celular em espécies como Bixa orellana e Zea mays. Este resultado origina-se da ausência da enzima isomerase da manose-fosfato, que impedindo a metabolização da manose-fosfato, causa efeitos negativos no processo glicolítico e na disponibilidade de ortofosfato. Esta característica pode, entretanto, ser útil para a seleção de regenerantes de tecidos desprovidos da enzima transformados com o gene manose-fosfo- isomerase. Assim, objetivou-se avaliar o efeito de manose na calogênese induzida em explantes foliares de Coffea arabica cv. Catuaí Vermelho IAC H2077-2-5-15 e C. canephora cv. Apoatã IAC LC 2258, que reagem favoravelmente à produção de calos friáveis embriogênicos (CFE) quando o carboidrato utilizado é sacarose. Explantes foliares desinfestados foram cultivados em placas de Petri contendo meios autoclavados constituídos de açúcar 30 Kg.m -3 , vitaminas de Gamborg combinados com macro e micronutrientes MS, cisteína 0,272 mol.m -3 , Gelriteä 0,3%, 2,4-D 4,6 mmol.m -3 e KIN 18,6 mmol.m -3 (NS), com macro e micronutrientes MS, cisteína 0,272 mol.m -3 , ágar 0,8% e BAP 20 mmol.m -3 (A) ou com macro e micronutrientes Yasuda, cisteína 0,165 mol.m -3 e BAP 5 mmol.m -3 (B). O componente açúcar foi suprido nas seguintes combinações sacarose:manose 3:0, 2:1, 1:1, 1:2 e 0:3. O pH foi ajustado para 5,6. As placas foram mantidas no escuro a 25 ± 2ºC. Quatro semanas após o início da indução, todos os explantes foram subculturados para os mesmos meios indutores, à exceção daqueles cultivados no meio NS, que foi modificado nas concentrações de macro e micronutrientes e de KIN, reduzidas à metade e para 4,6 mmol.m -3 , respectivamente, e na substituição da auxina, 2,4-D por ANA 0,54 mmol.m -3 . As renovações posteriores ocorreram a intervalos de quatro ou oito semanas. Após 24 semanas de pós-indução, os explantes de ambos os genótipos cultivados na seqüência NS produziram praticamente calos mistos, independentemente do tipo de açúcar no meio semi-sólido. Calos mistos são formações globulares compactas associadas a formações amorfas de células alongadas e moles ao tato, que se caracterizam por crescimento visivelmente mais rápido. Todavia, quando explantes foliares do arábica Catuaí Vermelho foram cultivados em meio A, a reação calogênica mais freqüente foi a cicatricial em resposta a todas as combinações de sacarose:manose, à exceção de quando a fonte de açúcar foi 100% manose, que induziu também calos embriogênicos em 7% dos explantes, aproximadamente. Relativamente aos explantes foliares do canéfora Apoatã cultivados em meio B, todas as razões sacarose:manose induziram CFE’s. Todavia, as maiores freqüências desta reação calogênica foram induzidas quando ambas as fontes foram utilizadas nos meios indutivos. A combinação das duas fontes duplicou, de maneira geral, as freqüências de CFE’s (60 a 72%) relativamente a apenas sacarose (32%). Os CFE’s obtidos foram utilizados para estabelecer culturas líquidas com vistas a estudos futuros relacionados à influência da razão sacarose:manose na cinética de crescimento e diferenciação embriogênica das cepas.