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Biotechnological approaches to improve drought tolerance of Coffea arabica
(Universidade Federal de Lavras, 2009-08-28) Stein, Vanessa Cristina; Paiva, Renato
Overexpression of SHINE gene induces the expression of these stress- related genes under normal growth conditions in transgenic plants and then confers the improved tolerance to drought. In recent years rapid procedures for obtaining transgenic roots have been developed using Agrobacterium rhizogenes, leading to the production of so-called “composite plants” comprising a transgenic hairy root system attached to non-transformed shoots and leaves. In the chapter II was determined the effect of (over)expression of the Arabidopsis SHN2 gene in stable and/or chimeric transgenic Arabidopsis thaliana and Brassica rapa plants subjected to drought treatment. In the chapter III was developed an efficient method for coffee genetic transformation by A. rhizogenes in order to create chimeric C. arabica (Catuaí Vermelho IAC 144) with wild-type shoots and transgenic roots for rapid testing of potentially interesting gene construct for future stable transformation using A. tumefaciens or A. rhizogenes and in the chapter IV was expressed the SHN2 gene of Arabidopsis thaliana in transgenic hairy roots of Coffea arabica after Agrobacterium rhizogenes-mediated root transformation in order to improve the drought tolerance of such chimeric plants. 50% of the 35S::SHN2 chimaric transgenic Arabdopsis plants exposed to 10 days withholding water and rewatered for one week recovered the drought treatment. In the coffee transformation 42% of hypocotyls infected A. rhizogenes contained pREDRoot plasmid had at least one transgenic roots and hypocotyls infected with A. rhizogenes contained pMOG22-35S::SHN2 and showed 32% of transformation. In the coffee drought experiment the DsRED (control) chimeric plants did not recover from the 15-day dehydration treatment and completely dried out all while the 35S:SHN2 chimeric plants recovered and become greener and stronger.
Cafeína exógena inibe o desenvolvimento in vitro de embriões de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre
(2003) Rosa, Sttela Dellyzete Veiga Franco da; Santos, Cíntia Guimarães dos; Paiva, Renato; Guimarães, Renato Mendes; Veiga, André Delly; Melo, Leonardo Queiróz de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A lenta germinação de sementes de café permanece não elucidada, embora seja sempre evidenciada em estudos sobre aspectos fisiológicos desta espécie. Têm sido sugeridas como prováveis causas, o impedimento à absorção de água e O2 pela presença do endocarpo, a presença de inibidores naturais ou o balanço hormonal. A cafeína, um alcaloide presente em sementes de cafeeiro perfaz de 1 a 2% do peso seco da semente ou uma média de 40 mM e pode inibir a germinação de sementes ou crescimento de plântulas, mas estudos da inibição de sementes de cafeeiro, por ação da cafeína endógena e ou exógena, são escassos. O presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito de cafeína exógena sobre a germinação e o desenvolvimento de embriões de Coffea arabica L. e de Coffea canephora Pierre. O experimento foi realizado nos laboratórios de Análise de Sementes/DAG e de Cultura de Tecidos/Fisiologia Vegetal/DB da UFLA, utilizando-se frutos no estádio cereja da cultivar Rubi. Após desinfestação dos frutos por 30 minutos de imersão em hipoclorito de sódio (2% i.a.) e lavagem por três vezes em água destilada e autoclavada, os embriões foram retirados e inoculados, de modo asséptico, em placas de petri com meio MS 50%, acrescido de sacarose e suplementado com diferentes concentrações de cafeína (0,00; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 e 0,40%). Os embriões foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2oC e intensidade luminosa de 13mmol.s-1.m-2 durante 23 dias quando avaliou-se o comprimento da parte aérea, comprimento de raiz e peso fresco das plântulas. Com cinco dias após o cultivo avaliou-se a porcentagem de germinação, computando-se os embriões com cotilédones abertos e com emissão de radículas, peso fresco de raízes e peso fresco de plântulas. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com 6 repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por 5 embriões. A germinação e o desenvolvimento de embriões de Coffea arabica L. e de Coffea canephora Pierre são afetados por cafeína exógena, sendo este efeito mais drástico nas radículas do que nos cotilédones. Em embriões de Coffea arabica L. concentrações de cafeína superiores a 0,20% afetam drasticamente a emissão de radículas. Já a emissão de radículas em embriões de Coffea canephora Pierre, não é afetada até as concentrações de 0,30%, indicando ser esta espécie menos sensível aos efeitos inibidores da cafeína exógena.
Criopreservação de embriões zigóticos de Coffea arabica por vitrificação
(Universidade Federal de Lavras, 2002-03-25) Freitas, Rodrigo Therezan de; Paiva, Renato
Devido à importância econômica e social do cafeeiro para o Brasil, é necessário que sejam adotadas medidas para a conservação do seu recurso genético. Entretanto, em consequência da dificuldade de armazenamento de sementes de café de forma convencional, alternativas biotecnológicas tal como a criopreservação tem sido requerida. Neste contexto, objetivou-se desenvolver um protocolo para a criopreservação de embriões zigóticos de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho (IAC 144) pela técnica de vitrificação. Primeiramente, avaliou-se a desinfestação das sementes e a excisão dos embriões zigóticos. Na desinfestação as sementes foram imersas em diferentes concentrações de formaldeído (0; 0,5; 1 e 1,5%) durante diferentes períodos de tempo (5, 15 e 30 min). Para a excisão dos embriões as sementes foram desinfestadas e imersas em solução de ácido bórico 0,5% durante diferentes períodos de tempo (1, 2 e 3 dias). Para o estudo de criopreservação, foram avaliados antes do congelamento diferentes tempos de imersão no Plant vitrification solution 2 (PVS2) (0, 10, 25, 50, 100, e 250 min) em duas temperaturas (0°C e 25ºC). Na sequência foi determinado o melhor tempo de descongelamento em banho-maria (1, 3, 5 ou diretamente em Recovery solution (RS)). Um estudo anatômico foi realizado em embriões zigóticos não criopreservados (controle), e criopreservado com ou sem o uso do crioprotetor PVS2. Posteriormente, foi realizada a aclimatização das plântulas oriundas de embriões criopreservados e não criopreservados. A completa desinfestação das sementes é obtida com 1 ou 1,5% de formaldeído por 30 min. A imersão das sementes por 2 ou 3 dias em solução de ácido bórico 0,5% torna as sementes mais maleáveis para a posterior excisão dos embriões, proporcionando 100% de germinação com plântulas normais. A criopreservação dos embriões zigóticos foi obtida com sucesso por meio da vitrificação. A imersão em solução crioprotetora por 100 min a temperatura de 0ºC permite a criopreservação dos embriões promovendo 80% de germinação com 87% de plântulas normais. Para o descongelamento os embriões zigóticos congelados podem ser descongelados diretamente em RS, eliminando a necessidade de uso do banho-maria. Anatomicamente, observou-se que a solução de PVS2 reduziu o conteúdo interno de água das células verificando-se plasmólises celular, permitindo o congelamento e a posterior retomada de crescimento dos embriões após o descongelamento. Em relação à aclimatização trabalhos adicionais são necessários para melhorar a taxa de sobrevivência das plântulas oriundas de embriões congelados, uma vez que apenas 13% das plântulas sobreviveram após a aclimatização.
Cryopreservation of coffee zygotic embryos: dehydration and osmotic rehydration
(Editora UFLA, 2016-07) Pinto, Maísa de Siqueira; Paiva, Renato; Silva, Diogo Pedrosa Corrêa da; Santos, Paulo Augusto Almeida; Freitas, Rodrigo Therezan de; Silva, Luciano Coutinho
Conservation of plant genetic resources is important to prevent genetic erosion. Seed banks are the most common method of ex situ conservation; however, coffee seeds can not be stored by conventional methods. Cryopreservation is a viable alternative for long-term conservation of species that produce intermediate or recalcitrant seeds, as coffee. The aim of this work was to cryopreserve Coffea arabica L. cv Catuaí Vermelho IAC 144 zygotic embryos, and analyse the effects of dehydration prior cryopreservation and osmotic rehydration after thawing, in embryos germination and seedlings formation after cryopreservation. Prior to cryopreservation, different dehydration times (0, 15, 30, 60 and 120 min) were tested. Dehydrated embryos were cryopreserved in liquid nitrogen for 1 hour, and after thawing were rehydrated by osmotic solutions. Dehydrated and non-cryopreserved embryos were also analysed. The test with 2,3,5 triphenyl tetrazolium chloride (TTC) was used to evaluate the embryos viability. Non-dehydrated embryos did not survive after freezing. Embryos that were dehydrated until 20% of the moisture content did not germinate when osmotic rehydration was not performed. In contrast, cryopreserved embryos with the same moisture content presented 98% germination when they were rehydrated slowly in osmotic solution. According to tetrazolium tests, embryos presented maximum viability (75%) after dehydration for 60 minutes (23% moisture content). Therefore, coffee zygotic embryos (Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho) can be successfully cryopreserved using physical dehydration in silica gel for 60 minutes (23% moisture content), followed by osmotic rehydration after thawing. This method allowed a germination of 98% of cryopreserved zygotic embryos.
Embriogênese somática direta e criopreservação de embriões de Coffea arabica L. cv. Catuí Vermelho
(Universidade Federal de Lavras, 2012-02-06) Pinto, Maísa de Siqueira; Paiva, Renato
A espécie Coffea arábica é comumente propagada utilizando sementes ou estacas, entretanto a embriogênese somática apresenta-se como alternativa para sua propagação com alta taxa de multiplicação e maior uniformidade. A embriogênese possibilita ainda a conservação do material genético da espécie utilizando técnicas de criopreservação. Vários explantes podem ser utilizados para formação de criobancos, dentre eles embriões somáticos e zigóticos. Objetivou-se neste trabalho desenvolver um protocolo de embriogênese somática direta a partir de folhas cotiledonares e criopreservar embriões somáticos e zigóticos de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho IAC 144 . Para indução da embriogênese somática foram utilizadas diferentes concentrações de BAP, sendo em seguida cada concentração combinada com a presença ou ausência de ABA durante a fase de maturação. Para germinação avaliou-se a adição de diferentes fontes de carbono ao meio de cultura, sendo os explantes posteriormente enraizados através da utilização de diferentes concentrações de ANA. Durante a aclimatização testou-se a influência de diferentes substratos na sobrevivência das plântulas. O número máximo de embriões somáticos foi obtido utilizando 18,35 mg L -1 de BAP. A utilização de ABA não foi significativa para a maturação dos embriões. Todas as fontes de carbono, exceto sorbitol, promoveram a germinação dos embriões somáticos, obtendo-se uma média geral de 74% de germinação. A utilização de ANA para o enraizamento não foi significativa, obtendo-se uma média geral de 80,57% de enraizamento, entretanto o número máximo de raízes foi obtido utilizando 2,7 mg L -1 de ANA. A aclimatização das plântulas foi bem sucedida independente do substrato utilizado obtendo-se uma média geral de 96% de sobrevivência. Para o experimento de criopreservação de embriões zigóticos foram testados diferentes tempos de desidratação e determinados os teores de umidade em cada um deles. Para avaliação da viabilidade utilizou-se o teste de tetrazólio. Após 120 dias de germinação, as plântulas obtidas foram aclimatizadas. Na medida em que se diminuiu o grau de umidade observou-se o aumento da taxa de sobrevivência, obtendo-se 98% de sobrevivência aos 117 minutos de desidratação. A máxima viabilidade obtida através do teste de tetrazólio foi 60% aos 108 minutos. A aclimatização foi feita com sucesso, sendo obtida a sobrevivência de 100% das plântulas. Apesar da criopreservação de embriões zigóticos ter sido feita com sucesso, não foi possível criopreservar embriões somáticos diretos de cafeeiro, não sendo observada a sobrevivência de nenhum embrião após a desidratação ou desidratação e congelamento.
Enraizamento in vitro e ex vitro de brotações das cultivares Acaiá cerrado (Coffea arabica) e Apoatã (Coffea canephora)
(2003) Santos, Cíntia Guimarães dos; Paiva, Renato; Soares, Fernanda Pereira; Soares, Gustavo de Araújo; Paiva, Patrícia Duarte de Oliveira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
O objetivo deste trabalho foi promover e comparar a eficiência do enraizamento in vitro e ex vitro das brotações de Coffea arabica ‘Acaiá Cerrado’ e Coffea canephora ‘Apoatã’, obtidas a partir da cultura de embriões. Foram utilizados como explantes, brotações de Coffea arabica ‘Acaiá Cerrado’ e Coffea canephora ‘Apoatã’, oriundas da cultura de embriões, com 90 dias de cultivo in vitro. Para o enraizamento in vitro, as brotações foram inoculadas em meio MS suplementado com 3% de sacarose e 0,65% de ágar, acrescido de diferentes concentrações de AIB (0, 2, 4 e 6 mg.L -1 ). Para o enraizamento ex vitro, as brotações foram transferidas para caixas gerbox, contendo vermiculita, envolvidas por sacos plásticos transparentes e mantidas sob sombrite, em sala de crescimento sob temperatura controlada de 25±1ºC. As brotações foram mantidas sob sombrite 70% por 7 dias. Para proporcionar um aumento gradual da intensidade luminosa, esse sombrite foi substituído por sombrite 50% e, posteriormente, para 30%, em intervalos de 7 dias. Maior percentagem de enraizamento in vitro para as cultivares ‘Apoatã’ (85%) e ‘Acaiá Cerrado’ (100%) foi obtida na presença de AIB, na concentração de 6 mg.L -1 e maiores comprimentos de raízes foram obtidos na ausência do regulador de crescimento. As brotações de ‘Apoatã’ apresentaram 70% de enraizamento ex vitro. Baixa percentagem (30%) de enraizamento ex vitro foi obtida em Coffea arabica ‘Acaiá Cerrado’.
Germinação in vitro de Coffea arabica e Coffea canephora
(2001) Santos, Cíntia Guimarães dos; Paiva, Renato; Gomes, Guilherme Augusto Canella; Paiva, Patrícia Duarte de Oliveira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A cultura de embriões in vitro permite a recuperação de embriões provenientes de cruzamentos interespecíficos, multiplicação rápida do material selecionado e, com isso, antecipar a época de plantio. Neste trabalho, foi determinada uma metodologia de cultura de embriões in vitro do C. canephora cultivar Apoatã e C. arabica cultivares Acaiá Cerrado, Rubi e Topázio. Para isso, foram testadas diferentes concentrações de BAP (0; 3,0; 6,0; 9; e 12 mg/L) disposto em um delineamento inteiramente casualizado, onde se pode determinar as concentrações ideais para as características número de sementes germinadas, número de folhas, comprimento do segmento nodal e número de brotações adventícias e comprimento de raízes. No caso das características avaliadas, observa-se que a germinação in vitro de embriões de café pode ser obtida utilizando-se meio de cultivo desprovido de BAP, e o uso de BAP inibe o desenvolvimento da radícula, independentemente da cultivar. Para a cultivar Apoatã, a obtenção de plântulas normais é possível apenas com a utilização de 9 mg/L de BAP. Para a cultivar Acaiá, a utilização de 12 mg/L BAP possibilita maior comprimento de segmentos nodais. Para a cultivar Rubi, a concentração de 12 mg/L BAP possibilita a maior obtenção de brotações adventícias (1,345 brotos/embrião) e o maior comprimento de segmentos nodais (1,20 cm). Para a cultivar Topázio, o maior número de folhas é alcançado com a utilização de 9 ou 12 mg/L BAP (3,59 e 4,23 folhas/plântula, respectivamente).
Indução de calos embriogênicos em Coffea arabica L. cv. Catuaí Amarelo
(Embrapa Café, 2015) Souza, Ana Cristina de; Paiva, Renato; Reis, Michele Valquíria dos; Carvalho, Milene de Figueiredo; Silva, Luciano Coutinho; Silva, Diogo Pedrosa Corrêa da; Nery, Fernanda Carlota; Sales, Thais Silva; Rosa, Stella Veiga Franco da
O cafeeiro (Coffea sp.) é um arbusto pertencente à família Rubiaceae e ao gênero Coffea. O grande valor comercial do Coffea arábica é devido ao fato de seus grãos apresentarem sabor mais pronunciado e refinado. A embriogênese somática é um importante método de multiplicação em larga escala de plantas in vitro e pode maximizar a propagação do cafeeiro. Além disso, apresenta aplicações práticas para estudos de desenvolvimento embriológico e como técnica conjunta aos trabalhos de transformação genética de plantas. Várias pesquisas de cultivo in vitro já foram desenvolvidas com a espécie, entretanto, existe uma grande variedade de cultivares carentes deste tipo de estudo. O objetivo deste trabalho foi de indução de calos embriogênicos em Coffea arábica L. cv Catuaí Amarelo. Plântulas de cafeeiro Catuaí Amarelo cultivadas in vitro foram utilizadas como fonte de explantes. As folhas foram excisadas (1 cm2), pequenos cortes foram feitos na nervura central para indução de calos e os explantes foram inoculados com o lado abaxial voltado para o meio de cultivo MS com metade da concentração dos sais, 10 μM de Cinetina e diferentes concentrações (0, 2,5, 5, 10 e 20μM) do ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D). Os explantes foram mantidos em sala de crescimento, no escuro e com temperatura de 25 ± 2 °C. Após 45 dias de cultivo, a porcentagem de formação de calos e formação de raízes foram avaliados e os dados submetidos à ANAVA. A formação de calos e de rizogênese foi significativa (p<0.001). O uso de 2,5 μM e 10 μM de 2,4-D promoveram maiores porcentagens de formação de calos em 51% dos explantes. Ocorreu a formação de rizogênese quando utilizado 2,5 μM ou ausência de 2,4 D. O tratamento com 10 μM de 2,4-D é o mais indicado para a indução de calos em explantes foliares da cultivar Catuaí Amarelo.
Inibição do desenvolvimento in vitro de embriões de Coffea por cafeína exógena
(Associação Brasileira de Tecnologia de Sementes, 2006-05-30) Rosa, Sttela Dellyzete Veiga Franco da; Santos, Cíntia Guimarães dos; Paiva, Renato; Melo, Patrícia Leonardo Queiroz de; Veiga, André Delly; Veiga, Adriano Delly
A cafeína, alcalóide conhecido como 1,3,7-trimetilxantina, é encontrada em sementes quiescentes de cafeeiro, perfazendo um total de 1,1 a 1,7% em Coffea arabica L. e 2 a 3% em Coffea canephora Pierre, localizada em sua grande maioria no endosperma, na forma livre no citoplasma das células ou complexada com ácidos clorogênicos. Com função fisiológica em plantas ainda não totalmente esclarecida, a cafeína causa efeito alelopático, seja inibindo a germinação de várias espécies, seja como anti-herbívoro ou como agente pesticida natural. A lenta germinação de sementes de café ainda não foi esclarecida e várias causas são apontadas, como presença do endocarpo, baixa absorção de água e O2, presença de inibidores naturais e balanço hormonal. Embora sugeridos, estudos sobre a inibição de sementes de cafeeiro por ação da cafeína endógena e ou exógena são escassos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar o efeito da cafeína exógena sobre a germinação e o desenvolvimento de embriões de Coffea arabica L. e de Coffea canephora Pierre. O experimento foi realizado utilizando-se frutos no estádio cereja das cultivares Rubi e Apoatã IAC-2258. Após desinfestação dos frutos por 30 minutos de imersão em hipoclorito de sódio (2% i.a.) e lavagem por três vezes em água destilada e autoclavada, os embriões foram retirados e inoculados, de modo asséptico, em placas de petri com meio MS 50%, acrescido de sacarose e suplementado com diferentes concentrações de cafeína (0,00; 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30 e 0,40%). Os embriões foram mantidos em sala de crescimento a 27 ± 2ºC e densidade de fluxo de fótons de 13µmol.m-2.s-1, durante 23 dias, quando foram avaliados comprimento da parte aérea, comprimento de raiz e massa fresca das plântulas. Cinco dias após o cultivo, foram avaliadas a porcentagem de emissão de radículas e cotilédones, computando-se os embriões com cotilédones abertos e radículas expandidas. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado com seis repetições por tratamento, sendo cada repetição constituída por cinco embriões. Concluiu-se que a germinação e o desenvolvimento in vitro de embriões de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre são afetados por cafeína exógena. O efeito detrimental da cafeína exógena em embriões de Coffea é maior nas radículas do que nos cotilédones. Embriões de Coffea arabica L. são mais sensíveis aos efeitos negativos da cafeína exógena do que embriões de Coffea canephora Pierre. A cafeína pode contribuir para a lenta germinação de sementes e o lento desenvolvimento de plântulas de cafeeiro.
Micropropagação e caracterização bioquímico anatômica em Coffea arabica e Coffea canephora
(Universidade Federal de Lavras, 2001-08-28) Santos, Cíntia Guimarães dos; Paiva, Renato
CAPITULO II – Cultura in vitro de embriões de Coffea arábica e Coffea canephora. Este trabalho avaliou o desenvolvimento das plântulas originadas a partir da cultura de embriões, oriundos de frutos armazenados em diferentes condições ambientais e o efeito do BAP (benzilaminopurina), em Coffea arábica 'Rubi', 'Topázio' e 'Acaiá Cerrado' e Coffea canephora 'Apoatã'. Embriões oriundos de frutos armazenados por 7 dias, em sacos de papel, em temperatura ambiente e sob refrigeração foram inoculados em meio MS solidificado com 7 g.L-¹ de ágar, suplementado com 30 g.L-¹ de sacarose e pH 5,8. Para avaliar o efeito do BAP, no desenvolvimento das plântulas, o meio MS foi acrescido com diferentes concentrações deBAP (0, 3, 6, 9,12 mg.L-¹). Após a inoculação, os embriões foram mantidos em sala de crescimento, sob fotoperíodo de 16 horas, 25±1°C e intensidade luminosa de 13 umol.s-¹.m-² durante 30 dias. Frutos de Coffea arábica 'Acaiá Cerrado', 'Rubi' e 'Topázio' e Coffea canephora 'Apoatã' podem ser armazenados em temperatura ambiente durante 7 dias. Maior comprimento da parte aérea é obtido com7 dias de armazenamento para 'Apoatã' e 'Rubi' e por 3 dias, para 'Topázio'; maior comprimento de raiz é obtido por 7 dias para 'Apoatã' e por 5 dias para 'Topázio'; maior peso da matéria fresca é obtido por 7 dias para 'Apoatã' e 'Rubi' e por 4 dias para ‘Topázio’. O BAP proporcionou maior número de folhas para 'Apoatã' e 'Topázio'; maior comprimento da parte aérea para 'Acaiá Cerrado' e 'Rubi' na concentração de 12 mg.L-¹; maior comprimento da parte aérea para 'Apoatã' e 'Topázio' na concentração de9 mg.L-¹. CAPÍTULO III. Enraizamento in vitro e Ex vitro de brotações de Coffea arábica e Coffea canephora O objetivo deste trabalho foi de promover o enraizamento in vitro e ex vitro, em brotações de Coffea arábica 'Acaiá Cerrado', 'Rubi' e 'Topázio' e Coffea canephora 'Apoatã', obtidas a partir da cultura de embriões. Para o enraizamento in vitro, as brotações foram inoculadas em meio MS suplementado com 3% de sacarose e 0,65% de ágar, acrescido de diferentes concentrações de AIB (0, 2, 4, e 6 mg.L-¹). Para o enraizamento ex vitro, as brotações foram transferidas para caixa de gerbox, contendo vermiculita, envolvidas por sacos plásticos transparentes e mantidas sob sombrite, em sala de crescimento sob temperatura controlada de 25±1°C. As brotações foram mantidas sob sombrite 70%, em intervalos de 7 dias foi substituído por sombrite 50% e em seguida por sombrite 30%. Após esse período, a cobertura plástica e o sombrite foram retirados, permanecendo por mais 7 dias. A aplicação de AIB aumenta a percentagemde enraizamento das brotações de cafeeiro. Maiornúmero de raízes é obtido usando 6 mg.L-¹ de AIB ao meio de cultura. Maiores comprimentos de raízes são obtidos na ausência do regulador de crescimento. E possível o enraizamento ex vitro de Coffea canephora 'Apoatã'. Baixas percentagens de enraizamento ex vitro são obtidos com Coffeaarábica 'Acaiá Cerrado', 'Rubi' e 'Topázio'. CAPÍTULO IV. Aclimatização de Plântulas de Coffea arabica e Coffea canéfora Este trabalho teve por objetivo testar uma metodologia para a aclimatização de plântulas de Coffea arábica 'Acaiá Cerrado', 'Rubi' e 'Topázio' eCoffea canephora 'Apoatã', obtidas in vitro por meio da cultura de embriões. As plântulas foram transferidas para caixa de gerbox, contendo vermiculita, envolvidas por sacos plásticos transparentes e mantidas sob sombrite, em sala de crescimento, sob temperatura controlada de 25±1°C. As brotações foram mantidas sob sombrite 70%, em intervalos de 7 dias esse foi substituído por sombrite 50% e, em seguida por sombrite 30%. Durante esse período a cobertura plástica foi parcialmente aberta, para redução gradual da umidade relativa. Após esse período a cobertura plástica e o sombrite foram retirados, permanecendo por mais 7 dias. É possível a aclimatização das plântulas de Coffea arábica 'Acaiá Cerrado', 'Rubi' e 'Topázio' e Coffea canephora 'Apoatã', utilizando-se sombrite 70, 50 e 30%, respectivamente, por período de 7 dias cada. CAPÍTULO V. Indução de formação de calos a partir de segmentos foliares e nodais de Coffea arabica e Coffea canéfora O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma metodologia para induzir à formação de calosde Coffea arábica e Coffea canephora através do uso de duas auxinas e a combinação entre auxina e citocinina. Para avaliar o uso de duas auxinas, segmentos foliares e nodais de plântulas das cultivares 'Rubi', 'Topázio' e 'Apoatã', obtidas in vitro, foram inoculados em meiode cultura MS 50%, suplementado com 3%de sacarose, 0,7% de ágar e diferentes combinações de 2,4-D e AIB. Para estudar o efeito entre auxina e citocinina, segmentos foliares das cultivares Rubi e Apoatã, de plântulas obtidas in vitro, foram inoculados em meio de cultura MS 50%, suplementado com 3% de sacarose, 0,7%de ágar e diferentes combinações de 2,4-D e BAP. Após a inoculação, os explantes, foram mantidos no escuro, em sala de crescimento à temperatura de 25±1°C, por um período de 45 dias. Segmentos foliares e nodais inoculados em meio desprovido de 2,4-D, AIB ou BAP não apresentaram formação de calos. O uso de BAP, em condições isoladas não apresentou formação de calos em segmentos foliares. A produção máxima de calos em explantes foliares é obtida utilizando-se 1mgL-¹ de 2,4-D para 'Rubi' e 'Topázio' (C. arábica) e 0,5 mg.L-¹ e para Apoatã (C. canephora). O 2,4-D induziua melhorformação de calos no explante nodal, independente de sua concentração em relação ao AIB. CAPÍTULO VI. Curva de crescimento, análise bioquímica e padrão proteico de calos obtidos a partir de segmentos foliares e nodais de Coffea arabica e Coffea canéfora O objetivo deste trabalho foi determinar a curva de crescimento e analisar bioquimicamente calos originados de segmentos foliares e nodais de plântulas de Coffea arábica 'Rubi' e 'Topázio' e Coffea canephora 'Apoatã', obtidas in vitro, a partir da cultura de embriões. Explantes foliares e nodais com aproximadamente 0,25 cm2 foram inoculados em meio MS 50%, suplementado com 3% de sacarose e 1mg.L-¹ de 2,4-D. Após a inoculação, os explantes foram mantidos em sala de crescimento, na ausência de luz, sob temperatura controlada de 25± 1°C. Para obtenção da curva de crescimento, os calos foram pesados a intervalos de 7 dias. A curva de crescimento de calos formados a partir de explantes foliares de 'Apoatã' apresenta crescimento tipo sigmoide, com cinco fases distintas de 'Rubi' e 'Topázio' 3 fases. As curvas de crescimento de calos, formados a partir de explantes nodais de 'Apoatã' e 'Rubi', apresentam um crescimento tipo sigmoide, com cinco fases distintas e 'Topázio' 3 fases. O teor máximo de proteína total, em calos originados de explante foliar, ocorrem com 63 dias de cultivo para 'Apoatã', e calos originados de segmento nodal apresenta teores máximos aos 63 dias de cultivo para 'Rubi' e entre 42 e 63 dias para 'Apoatã'. Os teor máximo de açúcar redutor em calos originados de explante foliar, ocorrem no dia de sua inoculação, para 'Apoatã' e 'Rubi' e com 21 dias de cultivo para 'Topázio', e calos originados do segmento nodal, no dia de sua inoculação para 'Apoatã' e 'Topázio' e com 63 dias para 'Rubi'. Diferenças quantitativas (intensidade das bandas) e qualitativas (presença ou ausência de bandas) são observadas entre o período de desenvolvimento de calos de 'Apoatã' e 'Rubi', originados de explante foliare nodal. CAPÍTULO VII. Características anatômicas do tecido foliar durante os processos de cultivo in vitro e in vivo de Coffea arabica e Coffea canephora Neste estudo objetivou-se determinar as características anatômicas do tecido foliar, durante os processos de cultivo in vitro e in vivo de Coffea arábica 'Rubi' e Coffea canephora 'Apoatã'. Folhas completamente expandidas, de ramos do terço superior de plantas mantidas no campo e de plântulas cultivadas in vitro, oriundas da cultura de embriões foram utilizados. As folhas foram fixadas em FAA 70% e conservadas em álcool etílico 70%. Os cortes anatômicos foram efetuados à mão. As estruturas foliares desenvolvidas in vitro e in vivo apresentaram organizações anatômicas diferentes. Os parênquimas paliçádico e lacunoso apresentam-se mais espessos no cultivo in vivo em relação ao cultivo in vitro. Não é observada a presença de esclerênquima no cultivo in vitro. O sistema vascular in vivo é mais desenvolvido que o in vitro.