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Características de crescimento e produção de pectinases por Klebsiella oxytoca isolada de frutos de café
(Universidade Federal de Viçosa, 1999) Genari, Ricardo; Silva, Daison Olzany; Universidade Federal de Viçosa
A bactéria Klebsiella oxytoca, isolada do interior de frutos de Coffea arabica, obtidos de plantio na Universidade Federal de Viçosa, em Viçosa - MG, foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 2,8 L, com 1,0 L de meio mineral, pH 7,0, contendo pectina cítrica Sigma como única fonte de carbono, na concentração final de 0,28% (p/ v). A cultura foi incubada a 25ºC, sem agitação, por 24 horas e alcançou população de 108 células por mililitro em menos de 20 horas. O tempo de geração, nessas condições, correspondeu a 60 min. A taxa de crescimento a 37ºC, nesse meio, pouco diferiu das taxas obtidas a 25ºC e 30ºC. K. oxytoca mostrou-se capaz de crescer nesse meio, sem a presença de sulfato de amônio e mesmo sob condições de anaerobiose. A enzima pectinolítica produzida foi a pectato liase, intracelular, induzida, que atua primordialmente sobre substrato não-metilado. A atividade ótima dessa enzima foi obtida em temperatura de 40ºC, pH 9,0, na presença de íons magnésio. A pectato liase possuiu uma Km de 4,51 mg/ mL e não perde atividade a -18ºC por 9 meses ou sob 40ºC por 1 hora e 40 min. As características físico-químicas da pectinase produzida foram similares às encontradas em outras bactérias e fungos. A bactéria secretou a pectato liase, quando foi cultivada em meio contendo pectina com massa molecular maior que 30.000 Da, obtida por ultrafiltração. A secreção dessa enzima foi inibida por algum composto de massa molecular entre 3.000 e 30.000 Da, presente na pectina ou por oligogalacturonídeos, que podem ser degradados de alguma outra forma pela bactéria. O substrato retido no interior de membranas de diálise de 2.000 e 14.000 Da induziu a maior secreção da enzima, sendo essa maior em membranas de 14.000 Da. Os compostos presentes na pectina cítrica Sigma, que interferiram em mecanismos de regulação da enzima, não foram ainda identificados. K. oxytoca cresceu rapidamente, quando amido, galacturonato, poligalacturonato, caseína e glicose foram utilizados como fonte de carbono. Entretanto, não se observou o crescimento, quando essa fonte foi a celulose. As enzimas despolimerizantes foram detectadas em níveis mínimos, característica de microrganismo endofítico. As bactérias endofíticas, por não causarem danos visíveis às plantas, devem possuir algum mecanismo regulatório para controlar a síntese e a atividade de suas enzimas. Os resultados indicam a potencialidade de K. oxytoca contribuir para os processos fermentativos em grãos de café.
Colonização de Coffea arabica L. por bactérias endofíticas promotoras de crescimento
(Universidade Federal de Viçosa, 2001) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Silva, Daison Olzany; Universidade Federal de Viçosa
Os protocolos de esterilização superficial e de isolamento de bactérias endofíticas foram estabelecidos para frutos e caules de café arábica. Um isolado bacteriano produtor de pectina liase extracelular foi fisiologicamente e fenotipicamente caracterizado. A incidência de microbiota epifítica e endofítica foi constatada em amostras de frutos de café arábica oriundas de diferentes localidades. Bactérias, leveduras e fungos filamentosos foram isolados, sendo em Viçosa 1.042 isolados epifíticos e 282 potencialmente endofíticos, em Serra do Salitre 71 isolados epifíticos e 28 potencialmente endofíticos e em Patrocínio 85 isolados epifíticos e 33 potencialmente endofíticos. As bactérias foram isoladas em maior número, sendo que os bastonetes predominaram sobre os cocos e, dentre os bastonetes, as bactérias Gram negativas. A colonização de explantes de Coffea arabica L. por bactérias endofíticas foi demonstrada in situ pela técnica de imunofluorescência e comprovada pela recuperação das bactérias após sua reintrodução. Cinco isolados de bactérias endofíticas promoveram o crescimento de explantes de Coffea arabica e Coffea canephora, indicando que a sua interação não é espécie-específica.
Colonização epifítica e endofítica de frutos de Coffea arabica L. por bactérias metilotróficas facultativas de pigmentação rósea
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Mezêncio, José Mário da Silveira; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias metilotróficas facultativas de pigmentação rósea (PPFMs - Pink-Pigmented Facultative Methylotrophs) do gênero Methylobacterium têm sido encontradas colonizando epifiticamente a maioria das espécies vegetais. As PPFMs participam do metabolismo de nitrogênio, induzem a germinação de sementes, utilizam o metanol catabolizado pelas plantas, produzem citocininas e podem proteger as plantas contra fatores adversos de ambiente. As PPFMs são facilmente reconhecidas pela coloração rósea de suas colônias em ágar nutriente, pelo seu crescimento em meio de cultivo com um composto orgânico C-1 como única fonte de carbono e pela formação de película ou anel superficial em cultura líquida estática. Embora bactérias PPFMs tenham sido isoladas de mais de 100 espécies de plantas, não há relatos anteriores de sua colonização em frutos de café. O objetivo do presente trabalho foi verificar a colonização epifítica e endofítica por bactérias PPMFs, antes da colheita, de frutos sadios de café arábica em diferentes estádios de desenvolvimento, amostrados em Viçosa, em Serra do Salitre e em Patrocínio, Minas Gerais. Cada amostra de frutos foi preparada seguindo-se as etapas de pesagem, lavagem em água de torneira corrente, lavagem individual dos frutos com detergente e desinfetante SANPIC e enxágüe com água de torneira corrente. A seguir, em condições assépticas, os frutos foram agitados em água esterilizada. Uma série de diluições em tampão fosfato a partir da água onde os frutos foram agitados foi plaqueada em meio sólido R2A, para o isolamento da microbiota epifítica. Os frutos pré-lavados, após esterilização superficial, foram triturados sob condições assépticas. O material triturado foi utilizado para o isolamento da microbiota endofítica em meio R2A. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi transferida para nova placa de meio R2A para obtenção de culturas puras. As características morfológicas dos isolados foram determinadas pela coloração de Gram. Os isolados bacterianos bastonetes coloração Gram negativo, tanto epifíticos com endofíticos, que apresentaram colônias com pigmentação rósea em meio R2A, foram cultivadas a 28°C em meio sólido glicerol-peptona (GP), em ágar nutriente e em cultura estática de caldo nutriente. Após duas semanas de cultivo, as culturas foram analisadas quanto à pigmentação em ágar nutriente, quanto à utilização de glicerol como fonte de carbono em meio GP e quanto à formação de anel róseo na superfície do caldo nutriente. Observou-se que isolados bacterianos epifíticos e endofíticos com características culturais de PPFMs do gênero Methylobacterium estavam presentes em todas as populações obtidas a partir de frutos de café coletados em Viçosa e nas duas localidades do Cerrado mineiro. As bactérias PPFMs isoladas a partir das populações obtidas em Viçosa representaram 13 e 16% do total de bastonetes Gram negativos epifíticos e endofíticos, respectivamente. Enquanto que nas populações do Cerrado, estas bactérias representaram, respectivamente, 61 e 50% dos isolados epifíticos e endofíticos. Concluiu-se, portanto que as bactérias PPFMs colonizam epifítica e endofiticamente os frutos de café arábica.
Comparação da microbiota da superfície de frutos de café (Coffea arabica L.) colhidos em duas localidades
(2000) Paula, Evandro Marcus de; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Pitta, Otávio P. L.; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A expressão final da qualidade da bebida do café é o resultado de um conjunto complexo de interação de fatores bióticos e abióticos, entre os quais se destaca a microbiota presente nos frutos durante os vários estádios de maturação. Este trabalho objetivou quantificar e caracterizar quanto à morfologia as populações microbianas encontradas na superfície dos frutos durante quatro estádios de desenvolvimento. As amostras de frutos de café arábica ‘Catuai Vermelho’ nos estádios verde, verde-cana, cereja e passa foram coletadas em Viçosa, MG, e Serra do Salitre, MG. Os grãos foram desinfestação individualmente para se determinar o número de células viáveis pela técnica de contagem de colônias em placas de Petri. A seguir foi feito o isolamento de microrganismos, a partir de colônias morfologicamente distintas, em cada uma das placas. Foram isolados 141 culturas a partir dos grãos amostrados em Viçosa, 85% delas sendo de bactérias, 10% de leveduras e 4% de fungos filamentosos. Diferentemente, de um total de 268 culturas provenientes dos isolados de Serra do Salitre, 94% foram bactérias, 2,5% leveduras e 3,5% fungos filamentosos. Nesta localidade, a diversidade de tipos morfológicos foi maior. Foi constatada a ocorrência da sucessão microbiana, a qual é evidente nos estádios cereja e passa. As culturas de bactérias, fungos filamentosos e leveduras provenientes das duas localidades foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para futuros estudos de biotecnológicos.
Comprovação do caráter endofítico de bactérias isoladas de frutos e caules de Coffea arabica L.
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Mezêncio, José Mário da Silveira; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias endofíticas que colonizam os tecidos vegetais internos e não causam danos à planta têm despertado grandes interesses por suas possíveis aplicações na agricultura e biotecnologia. Na prática, as bactérias são consideradas endofíticas quando isoladas ou extraídas de material vegetal, cuja superfície foi esterilizada. No entanto, o isolamento de bactérias a partir de tecidos superficialmente esterilizados demonstra, de forma apenas indireta, a colonização endofítica, fazendo-se necessária a demonstração da interação bactéria endofítica-planta in loco por meio de estudos microscópicos associados a técnicas imunológicas ou a técnicas moleculares. O caráter endofítico também pode ser confirmado pela recuperação da bactéria potencialmente endofítica após sua reintrodução na planta. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar o caráter endofítico de quatro isolados bacterianos obtidos de caules (CL8) e frutos cereja (F7-4, F6 e SS110) superficialmente esterilizados de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho, oriundos de Viçosa, Araponga, Serra do Salitre, MG e Londrina, PR. Cada isolado (suspensão em caldo nutriente contendo 10 7 a 10 8 UFC/mL) foi inoculado em explantes de ápice caulinar de Catuaí Vermelho, obtidos por embriogênese somática a partir de explantes foliares e cedidos pelo Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro/Bioagro/UFV. Como controles, foram utilizados explantes inoculados com caldo nutriente estéril. Após 12 dias na câmara de crescimento, a 25±2°C e fotoperíodo de 12h, os explantes foram esterilizados superficialmente e, em seguida, as folhas e os caules foram cortados em pedaços pequenos, em condições assépticas, e inoculados separadamente em tubos contendo caldo nutriente. As culturas obtidas em caldo nutriente foram repicadas para novo meio nutriente para avaliação de suas características e pureza. A colonização endofítica de C. arabica pelos isolados CL8, F7-4, F6 e SS110 foi observada pelo crescimento bacteriano em todos os tubos de caldo nutriente, com exceção dos tubos inoculados com folhas cortadas do explante inoculado com o isolado CL8. Este fato indica que o isolado CL8, que foi obtido de caule, apenas colonizou endofiticamente os caules dos explantes, no período avaliado. As culturas recuperadas apresentaram as características típicas de cada isolado e estavam puras. Não houve crescimento bacteriano a partir das folhas e dos caules cortados dos explantes controles. A colonização endofítica pelo isolado CL8 foi demonstrada in situ pela técnica de imunofluorescência indireta, utilizando-se antissoro específico produzido no Laboratório de Imunologia e Virologia Molecular/UFV. O isolado CL8 foi detectado no sistema vascular do caule de explantes de Catuaí Vermelho. O caráter endofítico dos isolados CL8, F7-4, F6 e SS110 foi, portanto, comprovado.
Crescimento e caracterização de pectina liase de Paenibacillus amylolyticus isolado de fruto de café (Coffea arabica L.)
(Universidade Federal de Viçosa, 2001) Paula, Evandro Marcus de; Silva, Daison Olzany; Universidade Federal de Viçosa
A bactéria Paenibacillus amylolyticus, isolada de frutos de café que tiveram sua superfície devidamente desinfestada, foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 125 mL, com 50 mL de volume de trabalho, em meio mineral suplementado com extrato de levedura 0,06% (p/v), com diferentes fontes de carbono, sempre a 0,3% (p/v) e pH 7,0, sendo a cultura incubada a 25oC, com agitação de 150 rpm ou sem agitação. A bactéria também apresentou crescimento quando o extrato de levedura foi substituído por tiamina 50 mg L-1 e outras vitaminas do complexo B, mas nunca quando alguns desses fatores não eram adicionados ao meio mineral. Paenibacillus amylolyticus cresce na ausência de sulfato de amônio, desde que extrato de levedura 0,06% (p/v) esteja presente, porém o mesmo não se verifica quando se substitui o extrato de levedura por tiamina 50 mg L-1. O microrganismo não foi capaz de crescer em anaerobiose provocada pelo borbulhamento de nitrogênio gasoso, tanto na presença quanto na ausência de sulfato de amônio, indicando que tal bactéria não é capaz de crescer em anaerobiose e fixar nitrogênio nessa condição. P. amylolyticus é capaz de crescer em pectina como única fonte de carbono e, para tal, produz pectina liase (PL), para lise deste carboidrato. A enzima PL acumula-se no meio mais eficientemente após 24 horas de crescimento, apresentando maior especificidade por pectina cítrica, quando utilizada como substrato enzimático. A atividade ótima de PL ocorre a 40oC e a termoestabilidade, até 45oC. Entre os valores de pH avaliados, PL apresentou atividade entre pH 5,6 e 8,6, sendo o ótimo 7,9. A adição de EDTA e íons metálicos na mistura de reação mostrou pequeno efeito na atividade da enzima, e os valores de Km e Vmax aparentes foram, respectivamente, de 6,61 mg mL-1 e 1,24 x 10-7 mol min-1 mL-1.
Detecção de microorganismos endofíticos em frutos de café
(Universidade Federal de Viçosa, 1999-08-13) Yamada, Cecilia Mioko; Silva, Daison Olzany
A presença e a distribuição de bactérias e leveduras em frutos de café, desinfestados superficialmente, foram observadas, ulilizando-se técnicas de microscopia com colorações biológicas e fluorocromo, inclusão em parafina e técnicas imunológicas. As preparações a fresco e de inclusão em parafina possibilitaram observar a existência de um gradiente de distribuição de bactérias e leveduras na polpa do café, com predomínio de leveduras em sua porção mais externa. Foram encontradas, também, bactérias nas sementes de café. A aplicação de fluoresceína diacetato, em cortes a fresco, não se mostrou eficiente, dada a dificuldade de visualização dos microrganismos in situ e a inespecificidade da reação. Os anticorpos específicos, para a bactéria Klebsiella oxytoca, foram obtidos; porém, a aplicação de imunofluorescência usando anticorpos como sonda, para detecção das bactérias,em tecidos de frutos de café, necessita de adaptações.
Detecção de microrganismos endofíticos em frutos de café
(Universidade Federal de Viçosa, 1999) Yamada, Cecilia Mioko; Silva, Daison Olzany; Universidade Federal de Viçosa
A presença e a distribuição de bactérias e leveduras em frutos de café, desinfestados superficialmente, foram observadas, utilizando-se técnicas de microscopia com colorações biológicas e fluorocromo, inclusão em parafina e técnicas imunológicas. As preparações a fresco e de inclusão em parafina possibilitaram observar a existência de um gradiente de distribuição de bactérias e leveduras na polpa do café, com predomínio de leveduras em sua porção mais externa. Foram encontradas, também, bactérias nas sementes de café. A aplicação de fluoresceína diacetato, em cortes a fresco, não se mostrou eficiente, dada a dificuldade de visualização dos microrganismos in situ e a inespecifidade da reação. Os anticorpos específicos, para a bactéria Klebsiella oxytoca, foram obtidos; porém, a aplicação de imunofluorescência usando anticorpos como sonda, para detecção das bactérias, em tecidos de frutos de café, necessita de adaptações.
Microbiota endofítica em frutos de Coffea arabica L.
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Paula, Evandro Marcus de; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Hara, André; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Os microrganismos estão intimamente associados a plantas, podendo colonizar os tecidos vegetais internos (microbiota endofítica) e a superfície de órgãos (microbiota epifítica). No preparo via seca do café, a fermentação ocorre na massa de frutos colhidos em diferentes estádios de desenvolvimento. Embora existam vários estudos mostrando que bactérias e leveduras participam desse processo fermentativo, a microbiota endofítica, presente nos frutos de café antes da colheita, tem sido pouco caracterizada. Os objetivos do presente trabalho foram quantificar e caracterizar morfologicamente a microbiota endofítica que coloniza frutos sadios de café arábica em diferentes estádios de desenvolvimento, antes da colheita. Os frutos foram amostrados em Viçosa em intervalos de 15 dias, nos seguintes estádios de desenvolvimento: chumbinho-pequeno, chumbinho-médio, verde, verde-cana, cereja e passa. Em Serra do Salitre e em Patrocínio foi realizada apenas uma amostragem de cada localidade, dos estádios verde, verde-cana, cereja e passa. Em cada estádio foram coletados 24 frutos sadios de 12 plantas (dois frutos sadios de cada planta). Em Viçosa, o procedimento foi repetido utilizando-se outras 12 plantas da mesma lavoura. Os frutos, após esterilização superficial com etanol 70% e hipoclorito de sódio a 5%, foram triturados sob condições assépticas. O material triturado foi utilizado para quantificação e isolamento da microbiota endofítica. A determinação do número de células viáveis foi realizada pela contagem de colônias em placas, em meio R2A. Os microrganismos endofíticos foram isolados a partir das placas de cada amostragem. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi transferida para nova placa de meio R2A, para obtenção de culturas puras. As características morfológicas dos isolados foram determinadas pela coloração de Gram. As populações potencialmente endofíticas encontradas nos diferentes estádios de desenvolvimento dos frutos variaram de 10 2 a 10 4 UFC/g de peso fresco do fruto, nas três localidades. Foram obtidas populações endofíticas a partir de frutos no estádio passa somente em Serra do Salitre. Em um total de 282 isolados obtidos em Viçosa, as bactérias representaram aproximadamente 84%, as leveduras 7% e os fungos filamentosos 9%. Em Serra do Salitre foram obtidos apenas isolados bacterianos (bastonetes Gram positivos e Gram negativos). Em Patrocínio, foram obtidas bactérias e leveduras, mas não fungos filamentosos. Entre os isolados bacterianos endofíticos das três localidades, os bastonetes predominaram sobre os cocos. Dentre os bastonetes, as bactérias Gram negativas foram isoladas em maior número. Todas as culturas potencialmente endofíticas foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para posterior identificação e futuros estudos biotecnológicos.
Promoção de crescimento de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre ex Froenher por bactérias endofíticas
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Pitta, Otávio P. L.; Pereira, Pollyana C.; Medina, Pilar X. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias endofíticas colonizam os tecidos vegetais internos e não causam danos visíveis à planta. Entre outros efeitos benéficos, as bactérias endofíticas podem promover o crescimento da planta hospedeira em função da produção de reguladores de crescimento, do aumento da absorção de minerais por sideróforos ou da fixação de nitrogênio. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar a promoção de crescimento em explantes da cultivar Catuaí Vermelho IAC-15 de Coffea arabica L. e em explantes da cultivar Apoatã de Coffea canephora Pierre ex Froenher por cinco isolados bacterianos (CL4, CL8, F7-4, F6 e SS110). Os isolados potencialmente endofíticos foram obtidos de caule e frutos cereja superficialmente esterilizados de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho, oriundos de Viçosa, Araponga, Serra do Salitre, MG e Londrina, PR. Os explantes, obtidos por embriogênese somática, a partir de explantes foliares, foram cedidos pelo Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro/Bioagro/UFV em duas categorias: explantes com segmento nodal contendo uma ou duas gemas (0,5 a 1,0 cm de altura) e explantes de ápice caulinar contendo três a quatro gemas axilares (1,0 a 2,0 cm de altura). Cada um dos cinco isolados bacterianos (suspensão em caldo nutriente contendo 10 7 a 10 8 UFC/mL) foi inoculado em um explante das duas categorias de Catuaí Vermelho e de Apoatã. Como controles, foram utilizados explantes não inoculados, explantes inoculados com caldo nutriente esterilizado ou explantes inoculados com suspensão bacteriana autoclavada. O total de 30 tratamentos foi disposto na câmara de crescimento em delineamento em blocos casualizados com quatro repetições a 25±2°C e fotoperíodo de 12h. Aos 24 e 52 dias após a inoculação, verificou-se que os isolados CL4, CL8, F7-4, F6 e SS110 promoveram o crescimento dos explantes de Catuaí Vermelho e de Apoatã, pois estes apresentaram desenvolvimento maior do que o dos respectivos controles. O fato de esses isolados obtidos de Catuaí Vermelho (C. arabica) terem colonizado explantes de Apoatã (C. canephora), indica que essa colonização não é espécie-específica. Além de promover o crescimento apical, os isolados promoveram a diferenciação de primórdios radiculares em alguns explantes. A rizogênese ocorreu também em um explante controle, no entanto, o desenvolvimento desse explante e o tamanho da raiz foram menores. Observou-se também que houve maior incidência de morte foliar entre os explantes controle do que entre os explantes colonizados pelas bactérias endofíticas. Estas bactérias apresentaram, portanto, potencial de uso como promotoras de crescimento na cultura de tecidos de café.
Quantificação e caracterização da microbiota da superfície de frutos de café (Coffea arabica L.) em Viçosa, MG durante a safra de 2000
(2000) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Paula, Evandro Marcus de; Pereira, Pollyana C.; Hara, André; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Amostras de frutos de café arábica cultivar Catuaí Vermelho IAC-99, em diferentes estádios de desenvolvimento, foram coletadas com o objetivo de quantificar e caracterizar morfologicamente a microbiota da superfície. Após o processamento das amostras, determinou-se o número de células viáveis pela contagem de colônias em placas. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi isolada e estocada. Um banco de culturas foi obtido, com um total de 1042 isolados, sendo 894 bactérias, 86 leveduras e 62 fungos filamentosos. Verificou-se uma sucessão de populações microbianas nos estádios de cereja e passa, com decréscimo da população de bactérias e aumento de fungos filamentosos e, especialmente, leveduras.