Transformação de café mediada por Agrobacterium tumefaciens

Abstract

O objetivo deste trabalho foi estabelecer protocolos de transformação genética mediada por Agrobacterium tumefaciens para as espécies C. canephora e C. arabica, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta, suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Para C. arabica, tecidos embriogênicos foram induzidos em meio WPM suplementado com 1,7 mM de BA e 0,7 mM de GA3. Os explantes e os tecidos embriogênicos foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídeo pCambia3301, que contém genes de b-glucuronidase (gus) e fosfinotricina acetiltransferase (bar), que confere resistência ao glufosinato de amônio, ou pIBI3, que contém o genes bar e ACC-oxidase de melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos e transferidos para meio ED no escuro e co-cultivados por quatro dias a 24oC. Após esse período, foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Tecidos embriogênicos de C. canephora e C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio foram submetidos à análise histoquímica do gene gus. A atividade do gene gus foi detectada em 82,2% dos tecidos de C. canephora testados e nos calos recém-formados de C. arabica resistentes ao glufosinato de amônio. A integração do gene bar foi confirmada em tecidos embriogênicos de C. canephora pela análise de PCR.The objective of this work was to establish a protocol for Agrobacterium-mediated transformation of C. canephora and C. arabica using the herbicide ammonium gluphosinate as selective agent. Explants of C. canephora were cultured on medium to induce direct embryogenesis supplemented with 5mM 2-iP for 3 weeks. Embryogenic tissue of C. arabica were induced on WPM medium supplemented with 1.7 mM BA and 0.7 mM GA3. The explants and embryogenic tissue were soaked in Agrobacterium tumefaciens EHA105 harboring the binary vector pCambia3301 containing b-glucuronidase (gus) and phosphinotricin acetyltransferase (bar) genes, which confers resistance to ammonium gluphosinate, or pIBI3 containing the bar gene antisense sequence of the gene coding for ACC oxidase from mellon. The explants were submitted to sonication for 2 seconds, and co-cultured on ED medium for 4 days in the dark at 24° C and transferred to selective ED medium containing 10 mM ammonium gluphosinate and 400 mg.l -1 cefotaxime. Ammonium gluphosinate-resistant embryogenic tissue of C. canephora and C. arabica were submitted to histochemical assay of gus gene. Gus gene activity was detected on 82.2 % of C. canephora tissue and on the newly formed ammonium gluphosinate-resistant callus of C. arabica. The integration of bar gene was confirmed by PCR analysis.