Regeneração de embriões somáticos de café (Coffea arabica L.) em meio líquido a partir de calos embriogênicos friáveis

Abstract

A embriogênese somática apresenta um grande potencial para clonagem de plantas elites de café (C. arabica L.). Entretanto, para se ter uma alta eficiência no processo, bem como uma redução substancial no envolvimento de mão de obra, é necessário que a metodologia seja otimizada, sobretudo, com a utilização de meio líquido, seja em frascos convencionais sob agitação ou, preferencialmente, em biorreatores. A regeneração de embriões somáticos foi conduzida a partir da inoculação de calos embriogênicos cultivados em Erlenmeyer contendo meio líquido sob agitação e em biorreatores de imersão temporária. Os calos embriogênicos foram isolados do explante original de folha após 4 a 5 meses de cultivo e transferidos para o meio líquido de regeneração na proporção de um grama de células para um litro de meio. Foi utilizado o meio de MS, meia força, acrescido de 10 mg de tiamina, 1 mg de piridoxina, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de glicina, 100 mg de mio-inositol, 100 mg de caseína hidrolisada, 400 mg de extrato de malte, por litro, e 3% de sacarose. Como reguladores de crescimento a presença de 2,0 mg/L de BAP e 0,25 mg/L de ANA foi essencial para a completa diferenciação dos embriões. Após um mês de cultivo, já era possível observar o aparecimento dos embriões globulares, em alta freqüência. Ao final do segundo mês de cultivo, praticamente apenas embriões eram observados nos frascos de cultivo. Ao final desse período, os embriões diferenciados foram transferidos para meio de maturação, quando foram avaliados os seguintes componentes: ácido abscísico (ABA) a 5,0 µM, sacarose (3,0 e 6,0%) e sorbitol (87,7 e 175,4 mM). Uma amostra dos embriões foi igualmente inoculada em meio de germinação, EG. Este meio apresentava a seguinte constituição: o meio de MS, meia força, acrescido de 10 mg de tiamina, 1 mg de piridoxina, 1 mg de ácido nicotínico, 1 mg de glicina, 100 mg de mio-inositol, por litro, e 2% de sacarose. Como reguladores de crescimento, foram adicionados BAP a 0,25 mg/L e AIA a 0,45 mg/L. Tanto na fase de diferenciação quanto na fase de maturação, foram anotados os pesos da matéria fresca inicialmente inoculada e após o cultivo por dois meses. Ao final do cultivo no meio de maturação, foi pesada uma amostra e contado o numero de embriões. A taxa de aumento no peso da matéria fresca foi calculada pela formula TCR=(lnPFf-lnPFi)/t, sendo PFf o peso da matéria fresca final, PFi o peso da matéria fresca inicial e t o tempo em dias. O tempo de dobramento da materia fresca foi calculado pela formula dt=0,693/TCR. O período de dobramento da matéria fresca foi em torno de 11 dias para a fase de diferenciação e 18,7 dias para a fase de maturação. O numero médio de embriões por grama de calo embriogênico inoculado foi de 313.000, variando de 239.827 para o tratamento com ABA a 5,0 µM a 421.217 para o tratamento com sacarose na concentração de 6%. Visualmente, os melhores tratamentos foram os com sacarose 3%, sorbitol 87,7 mM e sorbitol 175,4 mM. O meio EG conferiu igualmente um bom desenvolvimento dos embriões.