Desenvolvimento e utilização de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros resistentes a ferrugem

Abstract

A ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. é considerada em todo o mundo uma séria doença do cafeeiro que tem causado vários prejuízos para a cafeicultura. O uso de fungicidas é o método mais empregado para o controle da doença, porém sua aplicação deve ser feita de forma racional, para não inviabilizar a cultura e agredir o meio ambiente. Na busca por cultivares resistentes, já foram identificados nove genes dominantes de resistência a H.vastatrix presentes em cafeeiros de diferentes espécies. Uma potencial estratégia para introgredir esses genes de resistência no cafeeiro é o uso de marcadores moleculares. Logo, objetivou-se com esse trabalho, converter marcadores AFLPs ligados a locos de resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix em marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) e avaliar a eficiência do uso desses marcadores e de um microssatélite previamente identificado na Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Para isso, quatro combinações de primers AFLPs ligados à resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix foram clonados e sequenciados. Os marcadores SCAR desenvolvidos foram denominados de SCAFs e, posteriormente, validados nos genitores resistente Híbrido de Timor UFV 443-03; genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e em 247 indivíduos da população F 2 de mapeamento. Os dados foram codificados e analisados no programa GQMOL. Com as sequências dos SCARs foi feita uma busca local no banco de dados do genoma de referência de Coffea canephora utilizando a ferramenta BLAST, e-value de -27. A fim de identificar quais genes estão envolvidos nas regiões dos cromossomos onde os SCARs apresentaram maior similaridade, foi realizada uma busca local utilizando a ferramenta Gbrowse, e-value de -10. Para a realização da SAM foram genotipados o marcador SCAF2 validado e um marcador microssatélite SSR16 em indivíduos das populações F 3 e de retrocruzamentos suscetíveis . Na realização da fenotipagem dos 16 discos de folhas de 1,5 cm de diâmetro de cada planta dos genitores, da geração F 3 e dos retrocruzamentos foram inoculados com uredósporos da raça II. Após as inoculações, os discos foram colocados sobre uma tela de nylon e espuma, saturada com água e acondicionados no interior de um gerbox. Os gerbox contendo os discos de folhas, foram fechados e mantidos na ausência de luz durante 48 horas, a 22oC e, em seguida, transferidos para uma câmara sob condições controladas de temperatura de 22°C e 12 horas de luz. No momento em que os discos inoculados do genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) iniciou a esporulação, em torno dos 25 dias após a inoculação (dpi), foi iniciada a avaliação de resistência/suscetibilidade. Na validação dos marcadores SCARs apenas o marcador SCAF2 apresentou polimorfismo entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis, se comportando como marcador dominante em repulsão. Os outros marcadores SCARs desenvolvidos não apresentaram polimorfismo entre os cafeeiros quando os fragmentos foram analisados em gel de agarose. Logo, somente o marcador SCAF2 foi validado mantendo o mesmo ordenamento no grupo de ligação 2 (GL2) do mapa genético de ligação, ficando ligado a 0 cM do AFLP que lhe deu origem. Na busca local no genoma de C. canephora encontrou-se maior similaridade dos marcadores SCAF1, SCAF2 com o cromossomo 0, chamado de ChrUn, e maior similaridade dos marcadores SCAF3 e SCAF4 com o cromossomo 10. Na identificação dos genes, os marcadores SCAF1 e SCAF2 pertencentes ao GL2 do mapa genético apresentaram similaridade com alguns genes que codificam proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Na SAM, foi verificado que o uso dos marcadores moleculares permitiu selecionar indivíduos homozigotos dominantes para um dos locos e para os dois locos, sendo mais eficiente que a fenotipagem. Logo, com o desenvolvimento de marcadores SCAR e SSR16 intimamente ligados aos locos de resistência à ferrugem do cafeeiro e seu uso na SAM possibilitaram um avanço nos programas de melhoramento com a seleção precoce de indivíduos e também uma posterior clonagem posicional de genes ligados à resistência a essa doença.

Coffee leaf rust (CLR) caused by the biotrophic fungus Hemileia vastatrix (L.) Berk. & Broome is widely considered as a serious disease causing various damages to coffee production. The use of fungicides is the employed control method, though their application should be made in a rational manner to avoid hampering the culture and the environment. In search for resistant cultivars, nine dominant resistant genes to H. vastatrix have been identified in different coffee species. One potential strategy for the introgression of these resistance genes is the use of molecular markers. Therefore, the objective of this work was to convert AFLP markers linked coffee loci resistant to race I, II and pathotype 001 of H. vastatrix in SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) marker and evaluate the efficiency of these markers and a microsatellite marker previously identified in Marker Assisted selection (MAS). For this purpose, four primer combinations of AFLPs linked to resistant genes to race I, II and pathotype 001 of H. vastatrix were cloned and sequenced. Developed SCAR markers were named SCAF and later validated in the resistant parent Híbrido de Timor (UFV 443-03); susceptible parent Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) and 247 individuals of the F 2 mapping population. Data were coded and analyzed in GQMOL software. With the sequences of the SCAR, a local search was made in the reference genome of C. canephora database using the BLAST tool with e-value of 10 -27 . In order to identify genes in the regions of the chromosome where the SCAR showed greatest similarity, a local search was performed using the tool GBrowse with 10 -10 e-value. To perform the MAS, validated SCAF2 and microsatellite SSR16 markers were analysed in individuals of F 3 population and susceptible backcrossing. As part of phenotyping, 16 leaf discs of each parent plant, and the F 3 backcross generation were inoculated with race II uredospores. After inoculation, the discs were placed on a germination box with a nylon mesh and foam, saturated with water. The germination boxes containing the leaf discs were sealed and kept in the dark for 48 hours at 22 °C and then transferred into a chamber under 22 ° C and 12 hours of photoperiod. The susceptible parent Catuai Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) sporulation started around 25 days after inoculation (dpi), from there began the evaulation of individual from other pouplations. In the validation of SCAR marker, only SCAF2 marker showed polymorphism between the resistant and susceptible coffee, behaving as a dominant marker in repulsion. The other developed SCAR markers did not show polymorphism between coffee varieties when the fragments were analyzed on agarose gel. Yet, only the marker SCAF2 was validated keeping the same order in the Linkage Group 2 (GL2) of the genetic linkage map, being linked at 0 cM of AFLP from which it was developed. The local search in the C. canephora genome found greater similarity of SCAF1 and SCAF2 markers to chromosome 0, called ChrUn, and greater similarity of SCAF3 and SCAF4 markers to chromosome 10. In identifying genes, SCAF1 and SCAF2 markers belong to GL2 genetic map with some similarity to genes encoding proteins related to resistance to pathogens. In the MAS, it was found that the use of molecular markers allowing the selection of homozygous dominant for one of the loci for the two loci, being more efficient than phenotyping. Therefore, with the development of SCAR and SSR16 markers closely linked to coffee rust resistance loci and their use in the MAS enabled an advance in breeding programs with early selection of individuals and also a subsequent positional cloning of genes linked to resistance to this disease.