Purificação da polifenol oxidase e avaliação de métodos bioquímicos para aferir a qualidade da bebida do café

Abstract

Este trabalho teve como objetivos o isolamento e a purificação da polifenol oxidase em frutos de café no estádio chumbinho e a análise comparativa entre os resultados obtidos pelos degustadores da bebida (análise sensorial/padrão) e os obtidos pela atividade da polifenol oxidase, extraída e quantificada por diferentes metodologias e outros parâmetros físico-químicos e histológicos em amostras de cafés de diferentes qualidades provenientes de várias regiões do estado de Minas Gerias. A precipitação em sulfato de amônio, seguida pela passagem dos extratos, simultaneamente, nas colunas Pheil Sepharose e DEAE Sepharose, mostrou uma eficiência de purificação da polifenol oxidase de 365 vezes, revelando, na eletroforese, as isoformas 29 e 64 kDa que mostraram maior atividade na presença do ácido clorogênico. A proteína purificada de 29 kDa forneceu a seguinte seqüência do N-terminal: AGIVRYXG (alanina, glicina, isoleucina, valina, arginina, tirosina, X, glicina). Os dados de lixiviação de potássio, condutividade elétrica e a atividade da polifenol oxidase mostraram ser mais adequados para separar amostras de café consideradas de melhor qualidade (estritamente mole, mole, apenas mole) das de pior qualidade (duro e riado), colocando em último lugar a amostra rio. Estas características não se apresentaram eficientes em separar cafés dentro de suas diferentes classes. Os estudos histoquímicos e morfológicos da semente de café mostraram no café bebida mole, uma maior concentração de lipídeos nos bordos externos das sementes e estes se apresentaram como corpos lipídicos globulares bem definidos no interior dos protoplastos. Com a perda da qualidade da bebida, observou-se que os lipídeos se apresentaram homogeneamente distribuídos por toda a superfície do tecido nas sementes do café bebida dura e riada. Nestes tipos de cafés, verificou-se que os lipídeos não mais se apresentaram em corpos lipídicos bem definidos como no café bebida mole, mas sim extravasados no interior das células e nos espaços intercelulares, devido à perda da integridade da parede celular.This research cumed to isolate and purify polyphenol oxidase in coffee fruits at pinhead stage and comparative analysis between results obtained by polyphenol oxidase activity, extracted and quantified by different methodologies and other physico chemical and histological parameters in coffee samples with different beverage standard from various regions of Minas Gerais. The ammonium sulphate precipitation, followed by the extract purification respectively, in Phenyl Sepharose ans DEAE Sepharose showed an efficiency for polyphenol oxidase of 365 fold, appearing in eletrophoresis the isoforms 29 and 64 Kda, showed higher activity in the presence of chlorogenic acid. The purified protein of 29 Kda gave the following N-terminal: AGIVRYXG (alanine, glicine, isoleucine, valine, arginine, tiroisine, x, glicine). The potassium lixiviation, eletric conductivity and polyphenol oxidase activity data showed to fit better in coffee samples that discriminate better beverage quality (estritamente mole, mole, apenas mole) from poor beverage quality (duro, and riado), and in the last level, the sample "rio". These characteristics are not efficient to separate inside of the different classes. The seed coffee morphological and histochemical studies showed that in coffee that originate "mole" beverage, a higher lipid concentration in peripherical seed position ant these regions showed a well defined globular lipidic bodies in the protoplast interior. During the loss of beverage quality, it was noted that lipid were homogenously distribuited for all seed surface tissue in coffee with beverage "dura" and "riada". In these types of beveragem, it was observed that lipids were not organized in well defined lipidic bodies in coffee that originate "mole" beverage, but there were extravased in the cells interior and intercellular spaces due a loss of cell wall integrity.