Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína

Abstract

O café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.