Detecção e quantificação de ocratoxina A produzida por espécies de Aspergillus isoladas de grãos de café

Abstract

A ocratoxina A (OTA) é uma micotoxina com efeitos nefrotóxicos, carcinogênicos, teratogênico a imunotóxico, naturalmente encontrada em produtos agrícolas incluindo grãos de café. A ocratoxina A em café é produzida principalmente por espécies de Aspergillus da seção Circumdati e Nigri. A espectroscopia de infravermelho próximo (NIRS) é um método prático para a detecção de compostos orgânicos na matéria. Sendo particularmente útil por ser um método não destrutivo, preciso, de resposta rápida e de fácil operação. O principal objetivo deste trabalho foi verificar a produção de ocratoxina A por fungos do gênero Aspergillus, isolados de grãos de café, por meio das técnicas do ágar coco, da cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e da espectroscopia de infravermelho próximo. A PCR foi utilizada para a identificação das principais espécies de fungos produtoras de ocratoxina A, sendo elas: A. niger, A. carbonarius, A. ochraceus e A. westerdjikiae. O par de oligonucleotídeos específicos utilizado para identificação de A. niger foi satisfatório, sendo capaz de amplificar um fragmento de 372 pb. Sete isolados, dos 13 testados, representantes da seção Nigri, foram identificados como A. niger. Os demais pares de oligonucleotídeos iniciadores não foram eficientes na identificação das outras espécies de Aspergillus. A técnica do ágar coco foi utilizada como um screening para a identificação de isolados fúngicos potencialmente produtores de ocratoxina. Dos 47 isolados testados, 24 (51%) mostraram ser potenciais produtores de ocratoxina A através da formação de um halo fluorescente azulado. Dez isolados previamente testados pelo ágar coco foram analisados por CLAE, mostrando 2 falsos positivos e 2 falsos negativos, indicando que o ágar coco é um método que pode ser utilizado como screening, necessitando de análises confirmatórias. Na análise da NIRS, verificou-se que, para a detecção de ocratoxina A nas amostras de fungos, o modelo que utilizou dados obtidos por transmitância foi o melhor. Já para a quantificação da ocratoxina A, ambos os modelos, criados a partir dos dados de transmitância e reflectância apresentaram bons resultados. Entretanto, quando utilizados 3 números de variáveis latentes e seus respectivos valores da somatória dos erros das predições foi possível a confecção de um gráfico comparando esses dados com os modelos, verificando que o modelo que utilizou dados obtidos por transmitância obteve os melhores resultados. Concluiu-se que a utilização da NIRS para a detecção e quantificação de OTA em isolados fúngicos é uma metodologia viável e próspera, contudo, mais testes são necessários.Ochratoxin A (OTA) is a mycotoxin with nephrotoxic, carcinogenic, teratogenic and immunotoxic effects, naturally found in agricultural products including coffee grains. Ochratoxin A in coffee is mainly produced by Aspergillus species from section Circumdati and Nigri. Near infraed (NIR) spectroscopy is a practical spectroscopic procedure for the detection of organic compounds in matter. Being particularly useful because of its accuracy, rapid response, easy operation and a non- destructive method. The aim of this work was to verify the ochratoxin A production from fungi of Aspergillus genera, isolated from coffee beans, through coconut agar, high performance liquid chromatography (HPLC) and near infrared spectroscopy (NIRS) techniques. PCR was used to identify the ochratoxin A main producers species of fungi: A. niger, A. carbonarius, A. ochraceus and A. westerdjikiae. The pair of primers used to the identification of A. niger was satisfactory, being able to amplify a fragment of 372 pb. Seven isolates of 13 tested, representatives of the section Nigri were identified as A. niger. The other pairs of primers were not effective to identify the other species of Aspergillus. The technique of coconut agar was used as a screening for the identification of potential ochratoxin A producers fungal isolates. Of the 47 isolates tested, 24 (51%) proved to be potential producers of ochratoxin A through the formation of a halo. Ten isolates previously tested on coconut agar were analyzed on HPLC, showing two false positives and two false negatives, indicating that the coconut agar could be use only as a screening method, requiring confirmatory tests. The NIRS analysis showed that the model design from the transmittance data had a better result when detecting ochratoxin A. As for quantification of ochratoxin A, both models, design from transmittance and reflectance data showed good results. However, when using 3 numbers of latent variables and the values of their predictions errors sum, it was possible to elaborate a chart comparing them with the models, verifying that the model from transmittance data obtained the best results. Thus, the use of NIRS for the detection and quantification of ochratoxim A in fungal isolates is a viable and prosper methodology, however further tests are needed.