Criopreservação de embriões zigóticos de Coffea arabica por vitrificação

Abstract

Devido à importância econômica e social do cafeeiro para o Brasil, é necessário que sejam adotadas medidas para a conservação do seu recurso genético. Entretanto, em consequência da dificuldade de armazenamento de sementes de café de forma convencional, alternativas biotecnológicas tal como a criopreservação tem sido requerida. Neste contexto, objetivou-se desenvolver um protocolo para a criopreservação de embriões zigóticos de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho (IAC 144) pela técnica de vitrificação. Primeiramente, avaliou-se a desinfestação das sementes e a excisão dos embriões zigóticos. Na desinfestação as sementes foram imersas em diferentes concentrações de formaldeído (0; 0,5; 1 e 1,5%) durante diferentes períodos de tempo (5, 15 e 30 min). Para a excisão dos embriões as sementes foram desinfestadas e imersas em solução de ácido bórico 0,5% durante diferentes períodos de tempo (1, 2 e 3 dias). Para o estudo de criopreservação, foram avaliados antes do congelamento diferentes tempos de imersão no Plant vitrification solution 2 (PVS2) (0, 10, 25, 50, 100, e 250 min) em duas temperaturas (0°C e 25ºC). Na sequência foi determinado o melhor tempo de descongelamento em banho-maria (1, 3, 5 ou diretamente em Recovery solution (RS)). Um estudo anatômico foi realizado em embriões zigóticos não criopreservados (controle), e criopreservado com ou sem o uso do crioprotetor PVS2. Posteriormente, foi realizada a aclimatização das plântulas oriundas de embriões criopreservados e não criopreservados. A completa desinfestação das sementes é obtida com 1 ou 1,5% de formaldeído por 30 min. A imersão das sementes por 2 ou 3 dias em solução de ácido bórico 0,5% torna as sementes mais maleáveis para a posterior excisão dos embriões, proporcionando 100% de germinação com plântulas normais. A criopreservação dos embriões zigóticos foi obtida com sucesso por meio da vitrificação. A imersão em solução crioprotetora por 100 min a temperatura de 0ºC permite a criopreservação dos embriões promovendo 80% de germinação com 87% de plântulas normais. Para o descongelamento os embriões zigóticos congelados podem ser descongelados diretamente em RS, eliminando a necessidade de uso do banho-maria. Anatomicamente, observou-se que a solução de PVS2 reduziu o conteúdo interno de água das células verificando-se plasmólises celular, permitindo o congelamento e a posterior retomada de crescimento dos embriões após o descongelamento. Em relação à aclimatização trabalhos adicionais são necessários para melhorar a taxa de sobrevivência das plântulas oriundas de embriões congelados, uma vez que apenas 13% das plântulas sobreviveram após a aclimatização.

Due to the economic and social importance of coffee to Brazil, it is necessary that measures must be taken for the conservation of their genetic resources. However, due the difficulty to coffee beans storage, biotechnological alternatives such as cryopreservation has been required. In this context, the objective was to develop a cryopreservation protocol by vitrification technique for zygotic embryos of Coffea arabica L. cv. Red Catuaí (IAC 144). First, we evaluated the seeds disinfection and zygotic embryos excision. In seeds disinfestation, seeds were immersed in different formaldehyde concentrations (0, 0.5, 1 and 1.5%) for different periods of time (5, 15 and 30 min). For embryos excision the seeds were disinfected and further immersed in a boric acid solution 0.5% for different periods of time (1, 2 and 3 days). For the study of cryopreservation were evaluated before freezing different immersion times in Plant vitrification solution 2 (PVS2) (0, 10, 25, 50, 100, and 250 min) at two temperatures (0 °C and 25 °C). Following was determined the best thawing time in water bath (1, 3, 5 or directly in Recovery solution (RS)). A anatomical study was also conducted in zygotic embryos not cryopreserved (control), and in zygotic embryos frozen with or without the use of PVS2. It was subsequently set up the acclimatization of plantlets from cryopreserved embryos and not cryopreserved. The complete seeds disinfection was achieved with 1.5 or 1% formaldehyde for 30 min. Soaking seeds for 2 or 3 days makes more flexible seeds for the subsequent embryo excision, providing 100% germination with normal seedlings. Cryopreservation of zygotic embryos was successfully obtained by vitrification. Immersion in PVS2 solution for 100 min at 0 °C temperature allows cryopreservation of embryos promoting 80% germination with 87% of normal seedlings. For thawing the frozen zygotic embryos can be thawed directly in RS solution, thus eliminating the need to use water bath. Anatomically, it was observed that PVS2 solution decreases the internal water content of the cells observed by plasmolysis, allowing there freezing and subsequent growth resumption after thawing. Regarding acclimatization further work is needed to improve the survival rate of the seedlings derived from embryos frozen, since only 13% of seedlings survived after acclimatization. Keywords: Ex situ conservation. PVS2. Liquid nitrogen. Thawing. Histology.