Análise citológica e perfil de expressão gênica de Hemileia vastatrix (raça XXXIII) na interação com o cafeeiro

Abstract

A raça XXXIII de Hemileia vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado, não existem informações acerca da interação de cafeeiros com esta raça do fungo. Diante disso, um dos objetivos deste trabalho foi avaliar o processo de colonização do fungo e as respostas de defesa da planta em genótipos de cafeeiro resistente (Híbrido de Timor – HDT CIFC 832/1) e suscetível (C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1) infectados pela raça XXXIII. As primeiras respostas citológicas induzidas pelo fungo foram observadas particularmente nas células estomáticas de ambos os genótipos, às 17 horas após inoculação (hai), e corresponderam à morte celular e ao acúmulo de compostos fenólicos. No genótipo suscetível, o fungo foi capaz de colonizar os tecidos do hospedeiro e produziu um grande número de haustórios, culminando na esporulação cerca de 20 dias após a inoculação (dai). Ao contrário, no genótipo resistente, o crescimento do fungo foi impedido, com alta frequência no estádio pré-haustorial. Estas observações citológicas indicam que a resistência de HDT CIFC 832/1 à raça XXXIII de H. vastatrix é pré-haustorial, ao contrário da resistência pós-haustorial que é geralmente descrita para interações cafeeiro - H. vastatrix. Com base nesta análise, foram definidos os tempos mais adequados para o estudo de genes expressos ao longo do processo infeccioso. Embora o sequenciamento do transcriptoma tenha sido bastante utilizado em estudos de interação planta-patógeno, uma das maiores dificuldades consiste na separação dos transcritos provenientes da planta e do fungo, principalmente quando não existe genoma de referência. Por esta razão, foi realizado o sequenciamento e a montagem do transcriptoma de esporos hidratados e germinados da raça XXXIII de H. vastatrix. A montagem resultou em 32.882 contigs, a partir dos quais foi gerado um conjunto de 11.989 genes preditos. Plantas de C. arabica cv. Caturra Vermelho (CIFC 19/1) e Híbrido de Timor (CIFC 832/1) foram inoculadas com esporos frescos de H. vastatrix (raça XXXIII) para estabelecer uma interação compatível e incompatível, respectivamente. Como controle, foram utilizadas folhas não inoculadas. Nos tempos de coleta pré-definidos (12, 24, 96 horas e 17 dias após a inoculação), as folhas foram removidas e utilizadas para extração de RNA. O sequenciamento das dez bibliotecas de cDNA foi realizado na plataforma Illumina MiSeq, gerando um total de 206 milhões de reads. Após tratamento dos reads, foi realizado o mapeamento das bibliotecas da interação, utilizando como referência o transcriptoma de H. vastatrix previamente montado. Os dados obtidos mostraram que muitos genes de H. vastatrix são similares aos genes do cafeeiro, o que dificulta o estudo da expressão de genes na interação. Por outro lado, genes não conservados entre os dois organismos puderam ser avaliados quanto à sua expressão. Foi verificada a presença de muitos genes comuns às duas interações (compatível e incompatível), sendo que a grande maioria não apresentou expressão diferencial, principalmente nas fases iniciais do processo infeccioso. As maiores diferenças entre as interações foram encontradas aos 17 dai, consistindo principalmente de genes “no hit”, ou seja, genes que não apresentam similaridade com sequências dos bancos de dados de proteínas. Estas sequências podem corresponder a genes específicos de H. vastatrix. As informações geradas nesta pesquisa poderão auxiliar no melhor entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes expressos durante a infecção poderá auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.

The race XXXIII of Hemileia vastatrix was recently identified in Brazil, infecting some cultivars that had been released as resistant to coffee leaf rust. To gain new insights into the interaction between coffee plants and this race of the fungus, we evaluated the fungal growth and the plant defence responses in coffee genotypes resistant (Híbrido de Timor – HDT CIFC 832/1) and susceptible (C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1) to race XXXIII. The first cytological responses induced by the fungus were observed particularly in stomatal cells of both coffee genotypes by 17 hours post-inoculation (hpi) and corresponded to hypersensitive-like response (HR) and accumulation of phenolic-like compounds. In the susceptible genotype, the fungus was able to colonize the host tissues, produced a large number of haustoria and sporulated around 20 days post-inoculation (dpi). Reversely, in the leaves of resistant genotype, the fungus stopped its growth with higher frequency at pre-haustorial stages. These cytological observations indicate that the resistance of HDT CIFC 832/1 to race XXXIII of H. vastatrix is pre-haustorial, contrary to the post-haustorial resistance that is generally described for coffee - H. vastatrix interactions. Based on this analysis, the most suitable key time points of the infection process were defined, aiming at the study of differentially expressed genes in the interaction. Although the transcriptome sequencing has been widely used in plant-pathogen interaction studies, a major challenge is to separate transcripts from the plant and the fungus, especially in the absence of reference genomic sequences. For this reason, we performed the transcriptome sequencing and assembly of H. vastatrix (race XXXIII) hydrated and germinated spores. A total of 32.882 contigs were assembled, from which 11.989 genes were predicted. Plants of C. arabica cv. Caturra (CIFC 19/1) and Híbrido de Timor (CIFC 832/1) were inoculated with fresh spores of H. vastatrix race XXXIII to establish a compatible and an incompatible interaction, respectively. No inoculated leaves were used as control. In each time point (12, 24, 96 hours and 17 days post-inoculation), the leaves were removed and used for RNA extraction. Illumina MiSeq sequencing of ten cDNA libraries generated 206,000,000 reads. High quality reads of the H. vastatrix and coffee interacting transcriptomes were mapped against the H. vastatrix (race XXXIII) hydrated and germinated spores transcriptome previously assembled. The data showed that many genes of H. vastatrix are similar to coffee genes, which makes difficult the study of gene expression in the interaction. On the other hand, genes not conserved between the organisms could be evaluated for their expression. The presence of many common genes to both interactions (compatible and incompatible) was verified, and the majority did not show differential expression, especially in the early stages of the infection process. The major differences between interactions were found at 17 dpi, consisting mainly of genes that showed no similarity to protein databases. Those sequences can correspond to H. vastatrix specific genes. This investigation provides new insights into the coffee-rust interaction. The knowledge of gene expression profiling during the infection process may contribute to understanding the molecular mechanisms that lead to the breakdown of resistance by new physiological races of the fungus.