IDENTIFICAÇÃO DE CLONES BAC COM MARCADORES MOLECULARES VISANDO A INTEGRAÇÃO DE MAPAS FÍSICOS E GENÉTICOS

Abstract

Bibliotecas BAC (Cromossomo Artificial de Bactéria) têm sido muito utilizadas para suporte de trabalhos de mapeamento físico, clonagem posicional, mapeamento comparativo e estudos de evolução de genomas. Visando realizar o mapeamento físico em Coffea arabica, iniciamos a identificação e caracterização de clones BAC de uma biblioteca de C. arabica hibrido timor 832/2. A biblioteca contém 56.832 clones BACs com tamanho médio de 120 Kb, representando uma cobertura de 5,5 vezes o tamanho do genoma do C. arabica. Os clones da biblioteca BAC foram inicialmente agrupados em pools de placa com 384 clones, e superpools contendo 15 pools de placa o que representa 5.760 clones. A identificação do BAC de interesse foi realizada através da seleção por PCR nos superpools e pools, seguida por hibridização em filtros de colônia contendo 384 clones. Para a seleção dos superpools e pools de placas foram utilizados os primers baseados em AFLPs relacionados com lócus de resistência à ferrugem (M-8, SAT-244 e BA-124). Também foram utilizados os marcadores SSR-18 (GL1), SSR-16 (GL2), ACGG-1 (GL3), CCG-3 (GL6), de quatro grupos de ligação do mapa genético parcial de C. arabica (Oliveira et al, 2007) visando identificar e posicionar BAC para cada grupo de ligação. Os BAC selecionados nas hibridizações foram confirmados através de extração individual do clones, seguida por PCR para checar a marca de interesse. Até o momento foram identificados 32 clones BAC para as marcas de resistência a ferrugem e 98 para os 4 grupos de ligação. Os BAC selecionados serão sequenciados para o mapeamento físico da região contendo lócus de resistência à ferrugem.

BAC libraries have been extensively used in physical mapping, positional cloning and comparative studies of genomes evolution. With the aim to physical map genomic regions of Coffea arabica, we started the identification and characterization of BAC clones from a C. arabica hybrid timor 832/2 library. The library contains 56.832 BAC clones with average size of 120 Kb, representing 5.5 times the genome. For BAC identification, pooling of the clones was performed for each 384 well plate. After DNA extraction, the pools were grouped to form 15 super-pools of BAC-DNA, each clone representing approximately 5760 clones. For the identification of BAC of interest PCR screening in pools and superpools was performed, followed by colony filters hybridization containing 384 clones. To selection of plates pools and superpools, primers based on AFLPs linked to rust resistance locus (M-8, SAT-244 and BA-124) were used. We also used the markers: SSR-18 (GL1), SSR-16 (GL2), ACGG-1 (GL3), CCG-3 (GL6), from four linkage groups of partial genetic map of C. arabica to identify BACs and position for each ligation group. The selected BACs were confirmed by hybridization through the extraction of individual clones followed by PCR to check the marker of interest. So far were identified 32 BAC clones for resistance to rust markers and 98 for the four linkage groups. The selected BACs are going to be sequenced to perform physical mapping of the region containing the locus of resistance to rust.