Análise de expressão diferencial de proteases em sementes de Coffea arabica

Abstract

Cafés colhidos em regiões mais quentes apresentaram diferenças marcantes na qualidade da bebida ao mesmo tempo que níveis diferenciados de atividade de proteases. Diante dessas evidências observadas em nossos laboratórios, o presente estudo teve por objetivo estudar a expressão de genes envolvidos na produção de proteases em frutos de uma mesma variedade de café em diferentes estádios de desenvolvimento e de dois locais edafoclimaticamente distintos (Adamantina e Mococa). Cinco genes representando proteases do grupo asparagina e cisteína foram adotados para estudo de expressão diferencial em função de terem sido encontrados apenas em bibliotecas de fruto do banco de ESTs do Genoma café. Paralelamente, foram testados quatro genes constitutivos para serem utilizados como normalizadores da técnica de RT-PCR em frutos de café, tendo sido adotados GPDH C e CyP. As maiores diferenças de expressão foram observadas entre os diferentes estádios de maturação (frutos verdes e cerejas). Dentre os frutos coletados em Mococa, o verde expressou até 13,93 vezes mais que o cereja para o gene de Cis 5. Por outro lado, essa diferença de expressão não foi observada entre os dois estádios de maturação dos frutos de Adamantina. O gene Cis 8 de fruto verde foi mais expresso em ambas as localidades. O gene de Cis 22 apresentou menor taxa de transcrição no fruto verde que em fruto cereja, nas duas localidades avaliadas. Estes dados mostram que as transcrições desses genes variam durante a maturação dos frutos do café e provavelmente são influenciadas pelas condições ambientais de cultivo. Para avaliar a expressão diferencial das proteases em locais de cultivo que apresentam temperaturas contrastantes foram utilizados frutos em mesmo estádio de desenvolvimento, variando apenas a localidade. Três genes de cisteína revelaram valores significativos de diferença de expressão em Adamantina em relação a Mococa. No estádio cereja foi detectada uma diferença de expressão de protease aproximadamente 5 vezes maior em Adamantina em relação a Mococa para o gene Cis 5. Ao contrário, nos frutos verdes a expressão da Cis 5 foi em média três vezes maior em Mococa, onde a temperatura média anual é mais baixa do que em Adamantina. O gene similar a Cis 5, que codifica uma cisteina endopeptidase do tipo papaína do grão de mamona (Ricinus communis L.) possui a capacidade de processar o precursor da proteina glyoxysomal malate dehydrogenase e a literatura sugere que esta enzima tem como função transferir os metabólicos de um tecido para outro emergente. Apesar da influência das proteases na qualidade de bebida do café ainda dependa de análises bioquímicas e sensoriais, foi possível elucidar o estabelecimento de uma estreita relação na expressão dessas enzimas com fatores ambientais.Coffee grains harvested from regions with warmer climates produce distinctly different coffee drinks and simultaneously, present differential levels of protease activity. Based on evidences from our work along this research line, the present study aimed to profile the expression of genes involved in protease production in fruits of a coffee variety along the developmental stages and cultivated under distinct edapho-climatic sites (Adamantina and Mococa). Five genes representing proteases from asparagines and cysteine group were chosen for the expression analyses due to the fact that the corresponding ESTs were fruit-specific in Coffea Genoma databases. Simultaneously, we have investigated four constitutively expressed genes as normalizers for RT-PCR assays in coffee grains and have adopted GPDH C and CYP. The most significant expression differences were observed between the fruit ripening stages (green and "cherry" stage). Among the fruits harvested in Mococa, green fruits had up to 13.93 times higher levels of Cis 5 gene expression than observed in "cherry" stage fruits. In contrast, the expression pattern from fruits harvested from Adamantina did not present the fore mentioned difference. Cis 8 gene was highly expressed in green fruits from both locations. Gene Cis 22 presented lower expression rates in green fruits in comparison to "cherry" fruits in both locations. Taken together, our data demonstrate that the expression rates of these genes is variable along fruit ripening and are likely to be influenced by environmental crop conditions. In order to evaluate the differential expression of proteases in distinct cultivation sites showing contrasting temperature conditions, we have investigated the expression patterns of these genes in fruits harvested at the same developmental stage harvested in distinct locations. Three cysteine genes presented significant differential expression patterns in Adamantina, in comparison to Mococa. At "cherry" stage, the difference between the expression of protease gene Cis 5 was approximately 5-fold higher in Adamantina in comparison to its expression in Mococa. In contrast, in green fruits the expression of Cis 5 was, on average, a 3-fold higher in Mococa, where the mean annual temperature is lower than in Adamantina. A Cis 5-like gene that codes for a papain-type cysteine-endopeptidase from castorbean (Ricinus communis L.) is capable of processing the precursor of glyoxysomal malate dehydrogenase and it has been suggested that this enzyme functions in metabolite transfer from older to newly formed tissues. Although the determination of the influence of proteases on coffee drink needs further biochemical and sensorial analyses, it was possible to establish a close correlation between the expression of this enzyme and environmental factors.