Metodologias analíticas de referências para determinação de ocratoxina A em café beneficiado, torrado e/ou solúvel

Abstract

A análise química de Ocratoxina A (OTA) em café é complexa e envolve tempo e gastos de solventes em procedimentos de purificação como extração líquido-líquido, extração com fase sólida ou a combinação dos dois. A co-extração de substâncias ácidas juntamente com a OTA tem sido considerada um fator limitante na etapa de purificação, tanto para quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), quanto para análises por cromatografia de camada delgada (CCD). Métodos para determinação de OTA em café beneficiado, utilizando colunas de imunoafinidade (IAC), combinado com CCD e CLAE foram validados pelo LACQSA. Nestes métodos a OTA foi extraída pela solução de metanol: bicarbonato de sódio a 3% (1:1, v/v), a purificação do extrato foi realizada com IAC - OchratestÒ, seguida de eluição com metanol. A etapa de separação, detecção e quantificação da OTA pode ser realizada por CLAE e por CCD. Por CLAE, a separação foi realizada utilizando a fase móvel metanol:acetonitrila:água:ácido acético (35:35:29:1, v/v/v/v) e a detecção e quantificação por fluorescência e a confirmação da presença de OTA foi realizada por derivatização do extrato purificado com solução de trifluoreto de boro a 14% em metanol. A performance do método foi avaliada com ensaios de recuperação utilizando amostras de café beneficiado, artificialmente contaminadas (0,2 a 110mg/kg), em 12 níveis com no mínimo 5 repetições e com amostras naturalmente contaminadas. O método apresentou boa exatidão, com resultados de recuperação média (R) de 100,0 a 107,9 %. Os cromatogramas das amostras artificialmente e naturalmente contaminadas apresentaram perfil característico, com boa separação da OTA, e tempo de retenção em torno de 9 min. O método apresentou repetibilidade satisfatória, com desvio padrão relativo (RSD) entre 10,7 a 21,1%. A linearidade foi avaliada em relação à concentração teórica e determinada, com base no coeficiente de correlação apresentado pela curva (r =0,99). Os limites de detecção (LD) e quantificação (LQ) do método foram determinados e iguais a 0,12 e 0,20 mg/kg, respectivamente, contemplando o limite proposto pela União Européia. Testes utilizando CCD na etapa de separação, detecção e quantificação de OTA em café beneficiado, foram realizados, e as condições de análise, tipo de placa, fase móvel, solvente de retomada de amostras e linearidade de curva padrão foram determinadas. Tolueno:ácido acético (99:1, v/v) foi definido como solvente de retomada de extrato e de padrão resultando em maior sensibilidade da OTA. O uso de CCD unidimensional com quantificação visual e densitométrica foi possível quando as fases móveis tolueno:acetato de etila:ácido fórmico 88% (6:3:1, v/v/v) e acetonitrila:metanol:água:ácido acético glacial (35:35:29:10, v/v/v/v) foram usadas para fase normal e fase reversa, respectivamente. A recuperação média da OTA em amostras artificialmente contaminadas na faixa de 1,8-109µg/kg foi de 98,4% para quantificação visual e de 103,8% para quantificação densitométrica. O RSD variou de 1,1 a 24,9% e de 0,0 a 18,8% para análise densitométrica e visual, respectivamente. O RSD para amostras naturalmente contaminadas, quantificação densitométrica (três níveis de contaminação, n=3) variaram de 11,1 a 18,1%. A correlação (R 2 ) entre quantificação por CLAE e CCD/densitometria, e entre quantificação visual e densitométrica para amostras artificialmente contaminadas foi maior que 0,99. O LD do método foi 0,5 mg/kg para CCD, fase normal, comparável com àqueles publicados para CLAE. As porcentagens de recuperação e o RSD do método, tanto para quantificação visual quanto densitométrica, estão em conformidade com as características de desempenho consideradas aceitáveis para OTA na faixa de 1-10 mg/ kg pelo CEN (Comitê Europeu de Normalização). O método validado para determinação de ocratoxina A em café beneficiado, por CLAE, foi adaptado e validado para determinação de OTA em café torrado moído e solúvel. Devido à quantidade de interferentes presentes nas amostras de café torrado, fez-se necessárias alterações relacionadas com a massa da amostra extraída, a massa de amostra adicionada à IAC e o volume do solvente de extração foram alteradas. Outras adaptações foram realizadas no método no sentido de automatizar a etapa de purificação de amostra de café torrado (moído e solúvel). As condições de operação do processador automático de amostras - ASPEC, incluindo os parâmetros para purificação do extrato em colunas de imunoafinidade e injeção no cromatógrafo líquido foram determinadas. Os métodos foram disponibilizados em publicações como DOU, Food Additives and Contaminants, congressos nacionais e internacionais e em treinamentos de técnicos (Brasil e no exterior) oriundos de laboratórios, instituições e cooperativas envolvidas na pesquisa do café.