Análise in silico e in vivo da via de isoprenóides em café

Abstract

Os diterpenos cafestol e caveol, presentes na fração lipídica em grãos de café, originam-se da via de síntese de isoprenóides. Estes compostos são sintetizados em todos os organismos, sendo abundantes em plantas com cerca de 10 mil componentes relatados. Apesar da diversidade de funções e estruturas todos os isoprenóides derivam de cinco comuns átomos de carbono, o isopentenil difosfato (IPP) e do isômero dimetilalil difosfato (DMAPP). Em vegetais superiores, duas vias localizadas em compartimentos intracelulares separados estão envolvidas na biossíntese de IPP e DMAPP. No citosol, IPP é derivado da via do ácido mevalônico (MVA) e no plastídeo, IPP é formado pela via do metileritritol fosfato (MEP ou não mevalonato). Com a disponibilidade das seqüências dos genes expressos (ESTs) pelo Projeto Genoma Café tornou-se possível a identificação in silico e o estudo funcional dos genes que codificam para as enzimas 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductoisomerase (HMGR) e mevalonato difosfato decarboxilase (MPDC) para a via MVA e 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR) e isopentenil difosfato sintase (IDS) para a via MEP. Foram obtidas 13 ESTs de HMGR, que originaram três contigs incompletos, resultando em duas isoformas. Para o gene MPDC foram encontradas 7 ESTs que clusterizaram em somente uma isoforma, diferentemente de A. thaliana onde duas isoformas são encontradas. Para os genes da via MEP foram encontrados 22 ESTs para DXR e 47 ESTs para IDS que formaram apenas um contig para cada um destes genes. Southern blots dos genes HMGR e DXR também demonstraram a presença de duas isoformas para HMGR e uma para DXR em C. arabica. Análise da expressão por Northern blots detectou transcritos do gene DXR no começo de desenvolvimento do perisperma e nas fases finais de desenvolvimento de endosperma e polpa. Transcritos da isoforma HMGR2 foram detectados em polpa, perisperma e endosperma, em todas as fases de desenvolvimento do fruto. Entretanto, HMGR1 apresentou transcritos apenas em polpa e fase inicial do desenvolvimento de perisperma e endosperma.

The diterpenes khaweol and cafestol, which are present in the coffee lipid fraction, are originated from the isoprenoid pathway. Despite their diversity in functions and structures, all isoprenoids derive from the common-five carbon building unit isopentenyl diphosphate (IPP) and its isomer dimethylallyl diphosphate (DMAPP). In higher plants, there are two independent pathways located in the cytosol (mevalonic acid or MVA pathway) and in the plastids (methylerythritol phosphate – MEP pathway). Through the data mining of the Brazilian Coffee Genome Project we studied the genes that code for the enzymes 3-hydroxy-3-methyglutaryl-CoA reductase (HMGR) and mevalonate diphosphate decarboxylase (MPDC) for the MVA pathway, and 1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate reductoisomerase (DXR) and isopentenyl diphosphate synthase (IDS) for the MEP pathway. The search for HMGR resulted in 13 ESTs that originated three incomplete contigs, forming two isoforms. For MPDC 7 ESTs formed only one isoform, differently in A. thaliana that has two isoforms. The search for the genes in the MEP pathway resulted in 22 ESTs for DXR and 47 ESTs for IDS. In each case only one contig was formed, similar to found in A. thaliana as well. Southern blots of genes HMGR and DXR demonstrated the presence two isoforms for HMGR and one for DXR. Northern blot analysis detected transcripts of DXR at the beginning of the perisperm development and at the late stages of endosperm and pulp development. Transcripts of the isoform HMGR2 were detected in pulp, perisperm and endosperm, in all the stages of development of the fruit. On the other hand, HMGR1 transcripts were observed only in pulp and initial stage of the development of the perisperm and endosperm.