Efficiency of RNA extraction protocols in different types of coffee plant tissues

Abstract

In order to use sensitive techniques of molecular biology, such as the study of differentially expressed genes, a high- quality RNA in suitable quantities is necessary. Due to the presence of several varieties and often expressive quantities of secondary compounds in plants, there is no standard method for the isolation of nucleic acids that can be used for all species. Polyphenols and polysaccharides are the compounds that interfere the most in the extraction process, and when they are present, a low-quality RNA is produced. Four RNA extraction methods (CTAB method, Hot Borate, CONCERT and Tri Reagent), in four different coffee tissues (root, leaf, flower and fruit) were tested in this work, aiming at determining which method is more efficient. It was observed that the CTAB and Hot Borate methods, in which PVP and/or β -mercaptoethanol were added and precipitation with LiCl was performed, presented more pure RNA, with no degradation observed in any of the tissues, being suitable for further gene expression analysis. High-quality RNA was not obtained from any tissue in the extraction with Tri Reagent, which includes the use of phenol, and thus expression analysis was disturbed. The CTAB macroextraction method presented samples with the highest RNA quality and largest quantities in all tissues. Future works need to be carried out aiming the standardization of this macroextraction method.Para a utilização de técnicas sensíveis de biologia molecular, como o estudo de genes diferencialmente expressos, é necessário a obtenção de um RNA de boa qualidade e em quantidades adequadas. Devido à presença de grandes variedades, e frequentemente grande quantidade de compostos secundários em plantas, não existe um método padrão para o isolamento de ácidos nucléicos que possa ser utilizado para todas as espécies. Os polifenóis e os polissacarídeos são os compostos de maior interferência no processo de extração, e quando presentes geram um RNA de baixa qualidade. Nesse trabalho foram testados quatro métodos de extração de RNA (Método CTAB, Borato quente, CONCERT e Tri Reagente), em quatro diferentes tecidos de café (raiz, folha, flor e fruto), objetivando-se determinar qual método é mais eficiente. Foi observado que os métodos, CTAB e Borato quente, que possuíam a adição PVP e/ou β -mercaptoetanol, e precipitação com LiCl, foram os que apresentaram RNAs mais puros e sem degradação em todos os tecidos, e puderam ser utilizados para a análise de expressão gênica. Com a extração utilizando o TriReagente, que tem como base o fenol, não foi obtido RNA de boa qualidade em todos os tecidos e consequentemente não foi possível a análise de expressão. O método de macroextração CTAB foi o que apresentou amostras com RNA de melhor qualidade e em grandes quantidades em todos os tecidos. Trabalhos posteriores precisam ser realizados a fim de padronizar esse método para microextração.