Identificação de genes de Hemileia vastatrix candidatos a efetores capazes de ativar ou suprimir respostas de defesa no cafeeiro

Abstract

Durante a interação com a planta hospedeira, os fungos causadores de ferrugem secretam um arsenal de proteínas efetoras que modificam a estrutura e a função da célula hospedeira, permitindo o estabelecimento da interação biotrófica. Algumas dessas proteínas efetoras, denominadas proteínas de avirulência (Avr), são reconhecidas por proteínas codificadas por genes de resistência, o que desencadeia uma resposta de defesa da planta contra a infecção pelo patógeno. Estudos prévios demonstraram que a proteína HvEC-016 secretada por H. vastatrix apresenta características de proteína de avirulência quando expressa transientemente em genótipos de cafeeiros portadores do gene de resistência S H 1. No entanto, análises funcionais mais detalhadas ainda são necessárias para confirmar o papel dessa proteína durante a interação do patógeno com o cafeeiro. Desse modo, os objetivos deste estudo foram: (i) confirmar a atividade efetora da proteína HvEC_016 como fator de avirulência e/ou virulência em genótipos de cafeeiro com a presença ou ausência do gene de resistência S H 1; (ii) avaliar a estabilidade dos plasmídeos nos clones bacterianos utilizados nos estudos da expressão trasiente nos tecidos foliares de cafeeiro; (iii) identificar novas proteínas secretadas pela raça II de H. vastatrix (isolado Hv-01) que apresentam atividade de avirulência em cafeeiros com diferentes combinações de genes S H , utilizando o vetor de expressão transiente pEDV6 e o Sistema de Secreção Tipo III de Pseudomonas syringae pv. garcae (estirpe 1723). Confirmaram-se as atividades funcionais de avirulência e virulência da proteína HvEC_016 por meio da avaliação do crescimento populacional do clone Psg 1723 pEDV::HvEC_016 em plantas de cafeeiro com e sem o gene S H 1, respectivamente. A análise por PCR de colônia das células bacterianas isoladas a partir dos tecidos foliares infiltrados mostrou que o vetor pEDV6 apresentou estabilidade nos clones bacterianos analisados. A expressão transiente de cinco genes candidatos a efetores (HvEC_006, HvEC_054, HvEC_057, HvEC_081 e HvEC_101) suprimiu o desenvolvimento de sintomas da doença em cafeeiros portadores do gene S H 1. A análise do crescimento das populações desses clones em genótipos com ou sem o gene S H 1 deverá ser futuramente efetuada para comprovar os resultados obtidos. A expressão transiente de proteínas efetoras putativas no citoplasma do cafeeiro mediante a aplicação do sistema EDV constitui uma metodologia importante para a identificação de genes de avirulência e/ou virulência de H. vastatrix.

During the interaction with the host plant, rust fungi secrete a range of effector proteins, which modify the structure and function of the host cell allowing the establishment of the biotrophic interaction. The proteins encoded by resistance genes recognize some of these effector proteins, in this case also known as protein avirulence (Avr), and triggers a defense response in the plant that restricts further development of the pathogen. At least nine dominant genes (S H 1-S H 9) which provide resistance to the coffee rust have been genetically identified. In addition, genes from Hemileia vastatrix that encode secreted proteins have also been characterized. A protein secreted by H. vastatrix, HvEC_016, with potential avirulence activity when expressed transiently in coffee genotype carrying the resistance gene S H 1 was previously identified. This transient expression was obtained using the pEDV6 expression vector and the type III secretion system (T3SS) of Pseudomonas syringae pv. garcae. However, further functional analyses are required to confirm the role of HvEC_016 protein during the H. vastatrix interaction with coffee. Therefore, the purposes of this study were: (i) to confirm the HvEC_016 avirulence and/or virulence function in coffee genotypes with the presence or absence of the S H 1 resistance gene ; (ii) to analyse the stability of pEDV6 vector in the bacteria cells infiltrated into coffee leaves; (iii) to identify new proteins secreted by H. vastatrix (isolated HV-01) which have virulence activity in coffee plants with different combinations of S H genes, by analyzing five effector candidate genes (HvECs) using pEDV6 and the T3SS of Pseudomonas syringae pv. garcae (strain 1723). By analysing the population growth of the Psg 1723 PEDv::HvEC_016 clone in coffee plants, it was possible to confirm the avirulence and virulence activities of the HvEC_016 protein in the presence and absence of S H 1 gene, respectively. PCR analysis of bacteria colonies isolated from the infiltrated leaf tissue showed that pEDV6 vector is stable during the growth of the analysed clones in coffee leaves without selection. Transient expression of five genes HvECs (HvEC_006, HvEC_054, HvEC_057, HvEC_081 and HvEC_101) suppressed the development of disease symptoms in coffee genotypes with the S H 1 gene. Additional experiments are underway to confirm these results and to verify if these effectors have virulence activity in coffee genotypes without resistance genes. These results also demonstrate the potencial of pEDV6 and Pseudomonas syringae pv. garcae for functional studies of candidate effectors from H. vastatrix.