Identificação e caracterização de promotores de genes de café (Coffea arabica)

Abstract

A caracterização de promotores ubíquos, tecido-específicos ou induzidos sob determinada condição é importante para a produção e liberação comercial de plantas geneticamente modificadas. Este trabalho apresenta a identificação e caracterização de promotores de genes de café (Coffea arabica), uma cultura de grande importância sócio-econômica. Foram selecionados 41 genes candidatos com padrão de expressão constitutivo, fruto-específico ou relacionados com o mecanismo de defesa, através de dados da literatura e da análise in silico em bancos de ESTs disponíveis. A expressão constitutiva ou específica foi confirmada através de PCR quantitativa para somente 10 dos genes analizados. Os experimentos foram realizados em 5 diferentes tecidos/órgãos (raiz, caule, folha, flor e fruto) ou em plantas tratadas com o fungo biotrófico Hemileia vastatrix. Regiões promotoras de 4 genes foram isoladas através de genome walking: CaGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase como candidato constitutivo), CaAN2 (anthocyanin 2 específico de fruto), CaPR1b e CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 e Nonexpressor of PR genes, correspondentes a genes induzidos mediante a presença de agentes patogênicos). As regiões cis-reguladoras foram caracterizadas in silico e a funcionalidade dos promotores foi avaliada in planta através da expressão do gene repórter uidA em experimentos de transformação transiente em plantas de tabaco ou tomate. Além do interesse fundamental para a compreensão dos mecanismos de regulação gênica em eucariotos, os resultados desta pesquisa são importantes para o desenvolvimento de plantas transgênicas, apresentando também potencial em programas de melhoramento genético do cafeeiro. Palavras-chaves: Coffea arabica, expressão gênica, promotores, genes ubíquos, frutos, resistência de plantas.Le choix du promoteur dirigeant l’expression d’un gène d’intérêt est une des clés déterminantes des applications en biotechnologie végétale. L’objectif principal de cette étude est l’identification et la caractérisation de différents promoteurs chez le caféier (Coffea arabica), espèce végétale d’importance socio-économique élevée. Quarante-et-un gènes constitutifs, spécifiques de fruits, ou liés aux mécanismes de défense ont été sélectionnés d’après les données de la littérature et l’analyse in silico des bases de données d’ESTs disponibles. L’expression constitutive ou spécifique a été confirmée pour seulement 10 de ces gènes par PCR quantitative sur 5 tissus distincts (racine, tige, feuille, fleur et fruit), ou après traitement par le champignon parasite Hemileia vastatrix. Les séquences promotrices ont été isolées par marche chromosomique pour 4 gènes: CaGAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase comme candidat constitutif), CaAN2 (anthocyanin 2 spécifique de fruit), CaPR1b et CaNPR1 (basic form of Pathogenesis-Related protein type 1 et Nonexpressor of PR genes, inductibles par les agents pathogènes). Les séquences cis- régulatrices ont été caractérisées in silico et l’activité des promoteurs a été évaluée in planta à l’aide du gène rapporteur uidA par transformation transitoire de feuilles de tabac et de fruits de tomate. Au-delà de la caractérisation de promoteurs, utilisables pour l’amélioration génétique du caféier, cette étude apporte également des données fondamentales pour la compréhension des mécanismes de régulation d’expression génique chez les plantes pérennes.