Mapeamento físico da região cromossômica próxima ao gene de resistência a Meloidogyne exigua (Mex-1) em Coffea arabica L.

Abstract

O nematóide de galhas, Meloidogyne exigua, parasita o cafeeiro (Coffea sp.) e sua erradicação das regiões infestadas é impraticável. Estudos anteriores mostraram que a resistência a M. exigua é controlada por um gene de herança simples, designado Mex-1, presente em C. canephora. Linhagens de café arábica apresentando resistência têm sido desenvolvidas em programas de melhoramento genético por meio da introgressão deste gene. Uma biblioteca BAC de café foi avaliada inicialmente utilizando-se três marcadores (Exi-2, Exi-3 e Exi-4) ligados a Mex-1, obtidos a partir de marcadores AFLP previamente clonados. Os clones positivos associados à região Mex-1 foram identificados e isolados. O DNA destes clones foi então analisado por hibridização e amplificação com marcadores SCAR (Exi-2 e Exi-3) e 9 combinações de primers das extremidades BAC. Os clones BAC positivos, relativos aos marcadores Exi-2, Exi-3 e Exi-4, foram reunidos em 5 contigs. O primeiro contig apareceu composto de dois clones BAC identificados com o marcador Exi-4. Dos cinco clones BAC identificados com o marcador Exi-2, dois contigs designados Exi-2 I e Exi-2 II foram distintos. Os clones BAC Exi-3 foram organizados em dois contigs distintos chamados Exi-3 I e Exi-3 II. No total, nove sítios de restrição ou de PCR, correspondendo a sete marcadores físicos, foram localizados na região Exi-3. As três regiões cromossômicas correspondentes ao contig Exi-4, aos dois contigs Exi-2 e aos dois contigs Exi-3 não apresentaram sobreposição. A presença de clones BAC contendo análogos de gene de resistência (RGA) na região Mex-1 foi investigado por meio de amplificação com primers degenerados e hibridização com sondas RGA de café. Alguns clones BAC contendo RGAs foram identificados. Para confirmar a introgressão do gene Mex-1, vinte e uma linhagens de Icatu foram comparadas a três testemunhas resistentes, "Iapar 59", "Híbrido de Timor" e "Sarchimor" e a uma testemunha susceptível, "Catuaí". Foi avaliada, por meio de marcadores AFLP, a presença do fragmento introgredido associado ao locus Mex-1. Nove marcadores AFLP foram amplificados. Destes, os marcadores Exi-1, Exi-2, Exi-3, Exi-11 e Exi-13 confirmaram a presença do fragmento associado à resistência a M. exigua, mostrando que esta marca pode ser utilizada em programas de seleção assistida. Uma biblioteca de cDNA de "Caturra" foi utilizada para se isolar fragmentos de genes associados à resistência, através da hibridização com sondas RGA. Após a utilização das nove famílias RGA de café, 32 colônias foram isoladas e seqüenciadas. Destas, 25 seqüências não apresentaram similaridade com outras seqüências disponíveis na base de dados do NCBI ou não puderam ser seqüenciadas. Seis amostras continham seqüências muito pequenas e não confiáveis, e apenas uma amostra resultou em uma sequência de 428 nucleotídeos (142 aminoácidos). Esta seqüência apresentou alta homologia a catalases de outras plantas como Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Phaseolus vulgaris, entre outras. A esta catalase descoberta em café foi dado o nome de Cat-C. A catalase de ligação ao ácido salicílico (SR1) e a seqüência parcial de aminoácidos da proteína de ligação ao ácido salicílico (SABP), ambos de N. tabacum, apresentaram 82% e 77% de identidade, respectivamente, quando comparadas a Cat-C. Na região C-terminal desta catalase foi detectada a presença de uma seqüência peroxissomal. No entanto, ao invés de uma seqüência SRL (Serina-Arginina-Leucina), foi encontrada uma seqüência TRL (Treonina-Arginina-Leucina). Esta diferença é devido à troca de uma timina por uma adenina. Estes dados sugerem que Cat-C pode estar associado ao mecanismo de resistência em café.The root-knot nematode Meloidogyne exigua parasites the arabica coffee tree (Coffea sp.) and its eradication of the infested areas is impracticable. Previous studies showed that the resistance to M. exigua is controlled by a simple inheritance gene, designated Mex-1, present in C. canephora. Lineages of resistant Arabica coffee have been developed in some genetic breeding programs through the introgression of this gene. The BAC library of coffee was initially evaluated by three markers (Exi-2, Exi-3 and Exi-4) linked to Mex-1, previously obtained from cloned AFLP markers. The positive clones associated with Mex-1 region were identified and isolated. DNA clones were then analyzed by hybridization and amplification with SCAR (Exi-2 and Exi-3) markers and 9 combinations of primers of the BAC-end. The positive BAC clones, relative to the Exi-2, Exi-3 and Exi-4 markers, were assembled in 5 contigs. The first contig identified with the Exi-4 marker is composed of two positive BAC clones. Of the five BAC clones identified with Exi-2 markers, two contigs designated Exi-2 I and Exi-2 II were different from each other. The BAC clones Exi-3 were organized in two different contigs called Exi-3 I and Exi-3 II. In the total, nine restriction sites or PCR, corresponding to seven physical markers were located in the Exi-3 region. The three chromosomal regions that corresponded to the Exi-4 contig, the two Exi-2 contigs and the two Exi-3 contigs did not present any superposition. The presence of BAC clones containing resistance gene analogs (RGA) in the Mex-1 region was investigated by both PCR amplification with degenerate primers, and hybridization with coffee RGA probes. Some BAC clones containing RGA were identified. To confirm the introgression of Mex-1 gene, twenty-one Icatu lineages were compared to three resistant cultivars, Iapar 59, Hibrido de Timor and Sarchimor and to a susceptible cultivar Catuaí, through AFLP markers, evaluating the presence or not of the introgressed fragment associated with the Mex-1 locus. Nine AFLP markers were amplified. Among these, Exi-1, Exi-2, Exi-3, Exi-11 and Exi-13 markers confirmed the presence of the fragment associated to the resistance to Meloidogyne exigua, showing that this marker can be used in selected assistant programs. A cDNA library of "Caturra" was used to isolate fragments of genes associated with the resistance, through the hybridization using RGA probes. After the use of the nine coffee RGA families, 32 colonies were isolated and sequenciated. Among these, 25 sequences either did not present similarity with other available sequences in the NCBI data base or could not be sequenced. Six samples contained very small and not trustable sequences, and just one sample resulted in a sequence of 428 nucleotides (142 aminoacids). This sequence presented high homology to catalases of other plants such as Nicotiana plumbaginifolia, Glycine max, Phaseolus vulgaris, etc. To this discovered coffee catalase was given the name of Cat-C. The salicylic acid receptor (SR1) and the partial sequence of aminoacids of the salicylic acid binding protein (SABP), both in Nicotinana tabacum, showed 82% and 77% of identities, respectively, when compared with Cat-C. In the C-terminal region of this catalase was detected the presence of a peroxisomal sequence. However, instead of a SRL sequence (Serine-Arginine-Leucine), a TRL sequence was found (Treonine-Arginine-Leucine). This difference is due to the change of a timine by an adenine. These data suggest that Cat-C can be associated with resistance mecanism in coffee.