Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica

Abstract

A produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.

The production of physical maps in plants can provide applicable information for genetic and breeding research. The initial step to obtain a physical map is the construction of a genomic library with large DNA fragments. For this purpose, yeast artificial chromosome and more recently bacterial artificial chromosome (BAC) are the common vectors used for building those libraries. The objective of this work was to construct a BAC genomic library of Coffea arabica, which can be used for physical mapping as well to other genomic research. High molecular DNA fragments of C. arabica Timor Hybrid 832/2 was cloned into the pCC1BAC vector and transformed into E.coli DH10B. The ordering of the library in 384 well plates produced 55.778 clones with an average size of 115 to 120 KB. The coverage of the C. arabica haploid genome is estimated in 5x. Validation of the library for chloroplast and mitochondria DNA contamination is under way using colony filter hybridization.