Caracterização de raças fisiológicas e análise de proteínas candidatas a efetoras em população de Hemileia vastatrix no Brasil

Abstract

A ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, é considerada a principal doença da cultura. O fungo está amplamente distribuído nas regiões produtoras de café, causando severos danos econômicos. Novas raças fisiológicas de H. vastatrix tem surgido, com frequência em todo mundo, infectando algumas cultivares de café lançadas comercialmente como resistentes à ferrugem. Dessa forma, a obtenção de cafeeiros resistentes tem sido um desafio devido ao alto potencial adaptativo do fungo e tem se tornado cada vez mais difícil a caracterização dos patótipos por meio da coleção de cafeeiros diferenciadores de raça. Além disso, as informações acerca da interação de cafeeiros com as raças existentes são escassas, embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado. Estudos genômicos estão ajudando no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de interação entre planta e patógeno e no desenvolvimento de técnicas moleculares para a identificação de isolados. Nosso objetivo foi caracterizar as raças de H. vastatrix encontradas nas principais regiões produtoras de café do Brasil, e estudar as proteínas candidatas a efetoras preditas para H. vastatrix que possam contribuir para patogenicidade nas diferentes raças do fungo. Foram utilizados 56 isolados monopustular coletados de diferentes espécies de café, Coffea canephora, C. arabica e Híbrido de Timor (C. canephora x C. arabica) e multiplicados em cafeeiro suscetível C. arabica variedade Caturra. Cada isolado foi inoculado em cafeeiros que compõe a série diferenciadora de raças, com três repetições. O DNA dos 56 isolados monopustulares foram extraídos para os estudos genômico. Foram utilizadas 47 combinações de primer para amplificar genes de candidatos a efetores. Sete genes foram amplificados, sequenciados e tiveram sua expressão validada em cafeeiros resistente e suscetível. As sequências obtidas foram alinhadas para os 46 isolados, usando o programa DNA Baser. Estudo de domínio conservado foram realizados no programa Pfam e a categorização das proteínas no Blast2GO. O alinhamento das sequências de nucleotídeos, proteínas e agrupamento dos isolados foi feito no programa Clustalw e as diferença de nucleotídeo foi analisada no Weblogo. Os dados obtidos foram usados para o estudo de diversidade. Por meio da inoculação na série diferenciada, foram identificadas sete raças, sendo cinco já descritas no Brasil e duas pela primeira vez (raça XXIX e XXX). Não foi possível caracterizar 15 combinações dos genes de virulência, sendo assim consideradas novas raças. A análise da coleção de isolados permitiu inferir a presença de pelo menos seis novos genes na série diferenciadora, o que possibilitou diferenciar dois isolados descritos como raças III. Na análise genômica, os 47 genes candidatos a efetores estudados se mostraram conservados em todos os isolados e estão ligados a 15 processos biológicos do desenvolvimento do fungo. Foram identificados 14 domínios nas proteínas provenientes desses genes. Para os sete genes sequenciados nos diferentes isolados, observou-se diferença na sequência dos nucleotídeos e presença de indivíduos heterozigoto e homozigoto. Com análise de diversidade foi possível discriminar os indivíduos, sendo o isolado Hv-09 o mais divergente. As informações geradas nesta pesquisa poderão ampliar o entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes que estão envolvidos no processo infeccioso auxiliará o entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.

Coffee rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, is considered the main disease of the crop. The fungus is widely distributed in the coffee producing regions, causing severe economic damage. New physiological races of H. vastatrix have arisen, often all over the world, infecting some commercially released coffee cultivars as resistant to rust. Thus, obtaining resistant coffee trees has been a challenge due to the high adaptive potential of the fungus and it has become increasingly difficult to characterize the pathotypes through the collection of coffee races. In addition, information on the interaction of coffee trees with the existing races is scarce, although the infectious process of H. vastatrix is well studied. Genomic studies are helping to understand the molecular mechanisms involved in the process of interaction between plant and pathogen and in the development of molecular techniques for the identification of isolates. Our objective was to characterize the H. vastatrix race found in the main coffee producing regions of Brazil and to study the effector candidate proteins predicted for H. vastatrix that may contribute to pathogenicity in the different fungus races. Fifty six monopustular isolates collected from different coffee species, Coffea canephora, C. arabica and Hybrid of Timor (C. canephora x C. arabica) were used and multiplied in susceptible coffee C. arabica variety Caturra. Each isolate was inoculated in coffee plants that make up the differentiating series of races, with three replicates. The DNA of the 56 monopustular isolates were extracted for genomic studies. We used 47 primer combinations to amplify effector candidate genes. Seven genes were amplified, sequenced and had their validated expression in resistant and susceptible coffee trees. The sequences obtained were aligned for the 46 isolates using the DNA Baser program. A conserved domain study was performed on the Pfam program and the protein categorization in Blast2GO. The alignment of the nucleotide sequences, proteins and clustering of the isolates was done in the Clustalw program and the nucleotide differences were analyzed in Weblogo. The data obtained were used for the study of diversity. Through inoculation in the differentiated series, seven races were identified, five of which were already described in Brazil and two for the first time (races XXIX and XXX). It was not possible to characterize 15 combinations of the virulence genes, thus being considered new races. The analysis of the collection of isolates allowed to infer the presence of at least six new genes in the differentiator series, which made it possible to differentiate two isolates described as breeds III. In genomic analysis, the 47 candidate effector genes studied have been conserved in all isolates and are linked to 15 biological processes of fungus development. 14 domains were identified in proteins from these genes. For the seven genes sequenced in the different isolates, we observed a difference in nucleotide sequence and presence of heterozygous and homozygous individuals. With diversity analysis it was possible to discriminate individuals, being the Hv-09 isolate the most divergent. The information generated in this research may broaden the understanding of the interaction between H. vastatrix and the coffee tree. The knowledge of the genes that are involved in the infectious process will help the understanding of the molecular mechanisms that lead to the supplanting of resistance by new races of the fungus.