Caracterização funcional e identificação de SNPs e de genes de resistência a doenças do cafeeiro.

Abstract

O Projeto Brasileiro do Genoma Café gerou um banco de dados de 200.000 ESTs (Expressed Sequence Tags). Estas sequências estão armazenadas no banco de dados do Projeto, o CafEST. Em trabalho anterior, foi realizada análise in silico das sequências do CafEST, a qual permitiu a identificação de 14.060 sequências relacionadas com o processo de defesa da planta contra doenças. Dessas 14.060, 1.855 foram sequências cujos produtos preditos eram quitinases. Dada a importância das quitinases, tanto na interação planta-patógeno, como em outros processos da planta, as ESTs de quitinase foram detalhadamente analisadas no presente trabalho. Para isso foi realizada uma caracterização funcional e construído um perfil de expressão in silico. A categorização funcional foi feita com o software Blast2GO e o perfil de expressão gênica in silico foi determinado por meio de análises de Northern Blot Virtual. Os resultados da caracterização funcional mostraram a versatilidade das quitinases, que possuem atividade enzimática e estão envolvidas em importantes processos biológicos e funções moleculares nas células da planta. A análise do perfil de expressão in silico permitiu verificar que as quitinases estão mais expressas, principalmente, em bibliotecas que apresentam algum componente de estresse. Para selecionar, entre as 14.060 sequências mineradas, aquelas que estão envolvidas com a resistência do cafeeiro à ferrugem, foram desenvolvidos, em trabalho anterior, 40 pares de primers. Os primers foram testados em 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a Hemileia vastatrix, fungo causador da ferrugem. Vinte e nove primers resultaram em bandas únicas e bem definidas, sendo que um deles foi polimórfico entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis. No presente trabalho, 15 primers monomórficos foram escolhidos para análises de polimorfismos de base única (SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms) nas sequências de DNA entre os 12 cafeeiros resistentes e 12 susceptíveis a H. vastatrix. As sequências obtidas foram analisadas com os programas Sequencher® v. 4.10, ORF Finder, BLAST e ClustalW. Dos 15 genes, quatro não apresentaram nenhum SNP. Cinco genes apresentaram SNPs, mas os polimorfismos foram observados apenas para o clone da espécie Coffea liberica var. dewevrei (café excelsa). Os outros seis genes foram polimórficos entre os genótipos amostrados. Foram detectados 71 SNPs, sendo que 34 foram transições (47,89%) e 37 transversões (52,11%). A taxa de transições/ transversões foi de 0,9189. Das 71 substituições, 27 ocorreram na primeira posição do códon (38,02%), 15 na segunda posição (21,12%) e 29 na terceira (40,84%). Foram detectadas 11 (15,49%) substituições sinônimas e 60 (84,51%) substituições não sinônimas. A relação de substituições sinônimas/não sinônimas foi de 0,1833. Um alto nível de mutações não sinônimas, como o que foi encontrado neste trabalho, pode ser reflexo de seleção positiva. Um exemplo é o cenário antagonista da coevolução patógeno-hospedeiro, onde os genes do hospedeiro estão engajados numa “corrida armamentista” evolucionária e sob forte pressão de seleção para mudarem e se adaptarem. Em função disso, eles evoluem numa taxa mais rápida que outros genes. Este cenário pode ser aplicado ao presente trabalho, dado o alto nível de modificações não sinônimas detectado e ao fato que os genes analisados atuam, de alguma forma, no processo de defesa do cafeeiro contra patógenos. Foi observada uma frequência de 0,1029 SNPs por amplicon. Nos 119.061 pb analisados detectou-se uma frequência extremamente baixa de 1 SNP a cada 1.676,91pb, ou de 0,0596 SNPs por 100 pb. Pode-se atribuir o baixo nível de polimorfismo observado à baixa diversidade do genoma de C. arabica. A análise dos produtos gênicos permitiu verificar que as mutações não sinônimas identificadas não levaram à formação de proteínas preditas distintas. No presente trabalho foi também iniciada a clonagem de um gene potencialmente envolvido com a resistência do cafeeiro a ferrugem. Em trabalho anterior, foi identificado um fragmento de gene de resistência, amplificado pelo primer CARF 005, presente nos indivíduos resistentes e ausente nos susceptíveis à ferrugem do cafeeiro. Esse primer foi utilizado no presente trabalho para realizar um screening de uma biblioteca de BACs (Bacterial Artificial Chromosome – Cromossomo Artificial de Bactéria) contendo 56.832 clones Na identificação do(s) clone(s) positivo(s), utilizou-se o método de decomposição de pools. Foram identificados dois clones positivos (i. e. dois clones contendo fragmento de gene de resistência amplificado pelo marcador CARF 005). Os dados de sequenciamento dos dois clones identificados poderão fornecer informações importantes sobre a estrutura dos genes de resistência em Coffea.The Brazilian Coffee Genome Project has generated a database of 200,000 ESTs (Expressed Sequence Tags). These sequences are stored in the Project database, the CafEST. In silico analysis of the CafEST sequences was performed in previous work. It allowed the identification of 14,060 sequences related to the process of plant defense against diseases. Of the 14,060, 1,855 were sequences whose predicted products were chitinases. Given the importance of chitinases, both in plant-pathogen interaction, as in other plant processes, the chitinases ESTs were thoroughly analyzed in this study. For that, a functional characterization was carried out and an in silico expression profile was built. The functional categorization was accomplished using the Blast2GO software, and the in silico gene expression profile was determined by virtual Northern Blot Analysis. The results of functional characterization showed the versatility of chitinases, which have enzymatic activity and are involved in important biological processes and molecular functions in the plant cells. The in silico expression profile analysis has shown that chitinases are more expressed especially in libraries that have some component of stress. To select among the 14,060 sequences mined, those which are involved in the resistance of coffee to rust, a set of 40 pairs of primers were designed in previous work. The primers were tested on 24 coffee trees: 12 resistant and 12 susceptible to Hemileia vastatrix, fungus that causes leaf rust. Twenty-nine primers resulted in unique and well defined bands, one of which was polymorphic between resistant and susceptible trees. Of these primers, 15 were chosen for Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) analysis in DNA sequences between 12 H. vastatrix resistant trees and 12 susceptible ones. The sequences obtained were analyzed with the Sequencher® v.4.10, ORF Finder, BLAST and ClustalW programs. Of the 15 genes, four were monomorphic. Five genes showed polymorphism only for the Coffea liberica var. dewevrei species clone. The other six genes were polymorphic among the sampled genotypes. Seventy one SNPs were detected, of which 34 were transitions (47.89%) and 37 (52.11%) were transversions. The rate of transitions/transversions was 0.9189. Of the 71 substitutions, 27 (38.02%) occurred in the first codon position, 15 (21.12%) in the second position and 29 (40.84%) in the third. Eleven (15.49%) synonymous and 60 (84.51%) non- synonymous substitutions were detected. The ratio of synonymous/non- synonymous substitutions was 0.1833. A high level of non-synonymous mutations, as was found in this study, may reflect positive selection. An example is the antagonist scenario of the host-pathogen coevolution, where the host genes are engaged in an "arms race" and under strong evolutionary selection pressure to change and adapt. As a result, they evolve at a faster rate than other genes. This scenario can be applied to this work, given the high level of non- synonymous changes detected and the fact that the analyzed genes somehow act in the defense against coffee pathogens. A frequency of 0.1029 SNPs per amplicon was observed. In the 119,061 bp analyzed, an extremely low frequency of 1 SNP every 1,676.91 bp or 0.0596 SNPs per 100 bp was detected. The low polymorphism level observed can be attributed to the low diversity of the C. arabica genome. The gene products analysis has shown that the non- synonymous mutations do not lead to formation of distinct predicted proteins. Also, in the present work, the cloning of a gene potentially involved in resistance to coffee rust was initiated. In previous work, a resistance gene fragment was identified. The fragment, amplified by primer CARF 005, is present in the resistant individuals and absent in the coffee leaf rust susceptible genotypes. This primer was used in this study to perform a screening of a BAC (Bacterial Artificial Chromosome) library containing 56,832 clones. The pools fragmentation method was used to identify the positive clone(s). Two positive clones (i.e. two clones containing the resistance gene fragment amplified by marker CARF 005) were identified. The sequencing data from the two identified clones may provide important information about the structure of disease resistance genes in Coffea.