Transformação genética de Coffea canephora mediada por Agrobacterium tumefaciens com gene heterólogo de ACC-oxidase na orientação anti-senso

Abstract

O fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. Uma das alternativas para obtenção de plantas com maturação uniforme é o controle da síntese do fitorregulador etileno, pode ser feito através da transformação genética de plantas com genes da sua rota metabólica em orientação anti-senso. A enzima ACC oxidase, que catabolisa o último passo da biossíntese deste fitoregulador, tem sido um dos alvos preferidos para inibição com genes anti-senso, com uma conseqüente redução na produção de etileno. O objetivo deste trabalho foi introduzir o gene da ACC-oxidase do melão em plantas de C. canephora P. via Agrobacterium tumefaciens, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta ED (1/4 macro e 1/ 2 dos micronutrientes do meio MS, vitaminas do meio B 5 , 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de cisteína), suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Os explantes foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pIBI3 que contém os genes da fosfinotricina acetiltransferase (bar) e da ACC-oxidase do melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos, sendo em seguida transferidos para meio ED e co-cultivados por 4 dias a 24° C no escuro. Após este período, os explantes foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Inicialmente, 87 explantes foram co-cultivados e produziram 18 calos embriogênicos resistentes ao glufosinato quatro meses após a infecção. Embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem fitoreguladores para permitir germinação. As plântulas provenientes de cinco eventos independentes foram aclimatadas em casa-de-vegetação. A análise de PCR confirmou a presença de fragmentos amplificados do gene bar (516 pb) em 44 das 62 plantas analisadas. Em plantas controle (não transformadas) nenhuma amplificação foi observada. A análise de Southern blot foi conduzida para avaliar a integração do gene da ACC oxidase de melão em plantas de C. canephora P. Os resultados demonstraram a presença do transgene em todas as seis plantas analisadas. A dupla digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Hind III, liberou um fragmento de aproximadamente 1200 pb que hibridizou com a sonda correspondente ao transgene. Plantas transformadas e plantas controle foram pulverizadas com 1% (v/v) de uma formulação comercial de herbicida (Finale, AgrEvo â ) contendo 20% de glufosinato de amônio. Plantas controle demonstraram os primeiros sintomas de intoxicação 48 h após a pulverização devido a acumulação de amônia nos tecidos, e uma semana após as plantas estavam totalmente necrosadas. Nas plantas transformadas nenhum sintoma foi observado. As plantas estão em fase de crescimento em casa-de-vegetação. A determinação da produção de etileno será realizada, através de cromatografia gasosa, quando as plantas iniciarem a frutificação.