Inibidores de [alfa]-amilase e sua aplicação no controle da broca-do-café

Abstract

O Brasil é o maior produtor mundial de café, detendo 36% do mercado, e as espécies Coffea arabica (65%) e Coffea canephora (35%) são as mais comercializadas. As plantações de café são atacadas por uma série de pragas agrícolas, sendo a principal delas a broca-do-café (Hypothenemus hampei). Este coleóptero é bastante difícil de ser controlado, pois passa todo o ciclo de vida protegido dentro do fruto do café. O controle é restrito a utilização de inseticida carcinogênico e tóxico para o meio ambiente. Recentemente, foi demonstrando em experimentos in vitro que o inibidor [alfa]-AI1 do feijão Phaseolus vulgaris inibe a atividade das duas [alfa]-amilases presentes no trato intestinal da broca-do-café. Em nosso grupo de trabalho foi demonstrado que um inibidor de [alfa]-amilase presente em acessos do feijão selvagem Phaseolus coccineus ([alfa]IPC) é altamente ativo contra [alfa]-amilases desta praga. A disponibilidade em nosso laboratório destes gene e de técnicas eficientes para transformar geneticamente C. arabica e C. canephora tornaram possível a obtenção de plantas de café transformadas com o gene do inibidor [alfa]-AI1 e de embriões selecionados com o inibidor [alfa]IPC para o controle da broca. Utilizando a técnica de biobalística em calos embriogênicos de C. arabica foram obtidas 6 plantas positivas para o gene [alfa]-AI1, já identificadas via Southern Blot. Estas plantas apresentaram baixo número de cópias, 5 delas com 1 cópia e apenas uma planta com duas cópias do gene. Duas das plantas positivas por Southern Blot estão produzindo frutos e logo será possível avaliar o nível de expressão do inibidor [alfa]-AI1e a atividade dos frutos transgênicos no controle da broca-do-café via bioensaios. Os calos embriogênicos de C. arabica e C. canephora transformados com o inibidor de alfa-amilase do feijão Phaseolus coccineus estão em meio de indução de regenerando embriões dos calos selecionados. O resultado deste trabalho poderá resultar em cultivares de café menos impactantes ao meio ambiente, tornando o café brasileiro mais competitivo no mercado internacional.

Coffee is one of the most important products to the Brazilian agribusiness, reaching 2.53 million of tons in the 2006’s crop, corresponding to 36% of world market. The most cultivated species are Coffea arabica and Coffea canephora, which are both attacked by the coffee berry borer (Hypothenemus hampei), the most damaging insect pest of this crop. Interestingly, in vitro experiments demonstrated that the [alpha]-amylase inhibitor ([alpha]-AI1) of the common bean, Phaseolus vulgaris is able to inhibit the two [alpha]-amylases founded in the H. hampei digestive tract, turning the gene for this inhibitor a good candidate to be used in the control of this insect through plant genetic transformation. In this way, the main goal of this work is to obtain C. arabica plants genetically transformed with [alpha]-AI1 gene as an attempt to control the coffee berry borer. C. arabica calli were transformed through particle bombardment with pTA4 vector, containing the [alpha]-AI1 inhibitor gene under the control of phytohemaglutinin promoter and terminator, and the nptII gene for selection of transformed cells. After bombardment, the bombarded calli were transferred to the selection media in the presence of kanamycin as selection agent and maintained in the dark at 25°C ±2. After a 4 months selection period, the resistant calli were transferred to the regeneration media until the appearance of embryos and plantlets. Then, the plantlets were transferred to the green house and were evaluated through PCR and Southern blot analyzes. The genetic evaluations identified six transgenic plants containing the presence of [alpha]-AI1 inhibitor gene in the genome of the transformed coffee plants. Five of them exhibited one copy of the transgene, while one plant showed 2 copies. The data showed that the methodology applied was adequate to the introduction of new desirable traits with a low copy number in Coffea arabica plants. All the transformed plants are currently flowering and producing fruits, witch will allow the evaluation of expressed inhibitor level through ELISA and Western blot analysis and the insecticidal activity of transgenic fruits to the coffee berry borer.