Genomic identification, gene expression and enzyme activity of CAZymes from biotrophic fungus Hemileia vastatrix during coffee leaf infection

Abstract

Coffee leaf rust, caused by the fungus Hemileia vastatrix, is a major disease that affects many coffee producers around the world, causing a huge economic loss. H. vastatrix is a biotrophic fungus, hence, its growth and reproduction are totally dependent on the cells of the living host. Because of that, they infect the tissue without causing necrosis. Nevertheless, it is known that some fungi during plant interaction can express genes involved in the formation of infectious structures, as well as synthesize enzymes responsible for the degradation of the host cell wall. However, little is known about the importance of cell wall degrading enzymes (CWDE) for biotrophic phytopathogens. In this work, we performed genomic analysis to identify CAZymes (Carbohydrate Active EnZymes) from H. vastatrix and the analysis of expression and enzyme activity during experimental coffee infection. The first step was the ab initio prediction of H. vastatrix genome, using AUGUSTUS program, which was adjusted with H. vastatrix RNA-Seq for model determination. Functional annotation to identify CAZymes was performed using dbCAN2 meta server. Among the 345 CAZymes found, 162 belong to Glycoside Hydrolases (GH) including 34 endoglucanases, xylanases and polygalacturonases from families GH 5, 9, 10, 12 and 28 - which may act during fungal infection degrading the highest prevalent components of cell wall, represented by cellulose, xylan and pectin, respectively. Physico-chemical parameters of these enzymes were checked, including identification of catalytic residues and standard CAZymes motifs. The enzyme structures were also modelled. Moreover, analysis of expression of enzymes were performed using RNA-seq data from a genotype of C. arabica susceptible to infection, therefore presenting compatible interaction with the pathogen, after 0, 12, 24 and 96 hours after inoculation (hai). Enzyme activity assays were carried out in order to verify if these enzymes were also active during the fungal infection. The enzymes showed typical physico-chemical characteristics and structures of active enzymes including conservation of the catalytic sites. Genes encoding endoglucanases and xylanases were expressed during different times of H. vastatrix infection, being the first more expressed at 12 hai and the other at 24 hai. In agreement with expression data, endoglucanases started to be produced early, and were more active at 24 hai, whereas xylanases had greater activity at 96 hai. The results suggest that biotrophic fungus also use active enzymes on carbohydrates during the infection. In relation to H. vastatrix, these enzymes start being produced at the pre-haustorial phase of the fungal infection, but are more active at the post-haustorial phase, when the haustorium begins to be formed in the host membranes and in the plant cell wall.A ferrugem, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma das principais doenças do cafeeiro e gera grandes prejuízos econômicos. O H. vastatrix, por ser um fungo biotrófico, tem seu crescimento e reprodução totalmente dependentes das células do hospedeiro vivo. Sendo assim, infecta o tecido pelos estômatos, sem causar necrose. Apesar disso, sabe-se que alguns fungos durante a interação com a planta podem expressar genes envolvidos na formação de estruturas infecciosas, bem como sintetizar enzimas que auxiliam na penetração pela parede celular do hospedeiro. Pouco ainda se sabe sobre a importância das enzimas que degradam parede celular durante a infecção por fitopatógenos biotróficos. Aqui, realizamos uma análise genômica com o objetivo de identificar CAZymes (em inglês, Carbohydrate Active EnZymes) produzidas por H. vastatrix, além da análise da expressão gênica e atividade enzimática durante a infecção do cafeeiro. A primeira etapa foi a predição ab initio do genoma de H. vastatrix, utilizando o programa AUGUSTUS ajustado com dados de RNA-seq do próprio fungo para definição do modelo. A anotação funcional para identificar CAZymes foi realizada utilizando o programa dbCAN2. Dentre as 345 CAZymes encontradas, 162 pertencem às Glicosídeo Hidrolases (GH), incluindo 34 endoglucanases, xilanases e poligalacturonases das famílias GH 5, 9, 10, 12 e 28 - que podem atuar durante infecção fúngica degradando componentes da parede celular, representados por celulose, xilana e pectina, respectivamente. Parâmetros físico-químicos dessas enzimas foram preditos, incluindo identificação de resíduos catalíticos e domínios padrões de CAZymes na sequência primária e estrutura modelada. Além disso, análises de expressão das enzimas foram realizadas utilizando dados de RNA-seq de um genótipo de C. arabica suscetível à infecção, portanto apresentando interação compatível com o patógeno, nos tempos 0, 12, 24 e 96 horas após a inoculação (hai) com o fungo. Ensaios de atividade enzimática foram realizados para verificar se essas enzimas também atuam durante a infecção fúngica. As enzimas apresentaram características físico-químicas e estruturais típicas de enzimas ativas, incluindo a conservação dos sítios catalíticos. Genes que codificam endoglucanases e xilanases são expressos em diferentes momentos da infecção por H. vastatrix, sendo o primeiro mais expresso em 12 hai e o segundo em 24 hai. Em concordância com os dados de expressão, as endoglucanases começam a ser produzidas precocemente e são mais ativas a 24 hai, enquanto as xilanases têm maior atividade a 96 hai. Esses resultados sugerem que fungos biotróficos também utilizam enzimas ativas sob carboidratos durante a infecção. No caso de H. vastatrix, essas enzimas começam a ser produzidas na fase pré-haustorial da infecção do fungo, mas são mais ativas na fase pós-haustorial, quando o haustório já começa a ser formado nas membranas do hospedeiro e na parede celular da planta.