Transformação de Coffea canephora P. com gene para resistência à herbicida através de bombardeamento de partículas

Abstract

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protocolo de transformação de Coffea canephora P. através de bombardeamento de partículas, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes foliares de C. canephora foram usados para indução de embriogênese somática. Inicialmente, explantes foram cultivados em meio ED suplementado com 5 mM de 2iP por 40 dias. Explantes com embriões somáticos foram então transferidos para meio contendo a metade da concentração dos macro e micronutrientes dos sais de MS suplementado com 9 mM de 2,4 D. Após duas semanas, explantes com embriões somáticos e tecido embriogênico foram bombardeados com partículas de tungstênio (M-25) cobertas com o plasmídio pCambia 3301 (contendo os genes bar e gus), usando um sistema de aceleração de partículas com alta pressão de hélio (PDS 1000/He - BioRad). As condições usadas para o bombardeamento foram: 1.300 psi de pressão; 60 ou 90 mm de distância percorrida pelas partículas; e pré e pós-cultivo dos explantes em meio com alta osmolaridade. Os explantes bombardeados foram submetidos a seleção em meio ED contendo 5 mM de glufosinato de amônio. Após seis meses, embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem reguladores de crescimento para germinação. A análise histoquímica do gene gus nessas plântulas foi positiva, enquanto nenhuma atividade foi observada em plantas controle. A integração do gene bar foi confirmada pela análise de PCR.Our objective was to develop a transformation protocol for Coffea canephora P. by particle bombardment using the herbicide ammonium gluphosinate as selective agent. Leaf explants were cultured on ED medium supplemented with 5 ? M 2iP for 40 days. Explants with somatic embryos were transferred to half strength MS medium with 9 ? M 2,4 D. After 2 weeks, the explants with somatic embryos and embryogenic tissue were bombarded with tungsten particles (M-25) carrying the plasmid pCambia 3301 (containing the genes bar and gus) using a high pressure helium microprojectile device (PDS 1000/He - BioRad). The conditions used for bombarment were: 1300 psi pressure; 60 or 90 mm distance between sample and DNA particle holder; and pre and post-culture of explants on high osmolarity medium. The bombarded explants were submitted to selection on ED medium containing 5 ? M ammonium gluphosinate. After 6 months, putative transgenic embryos were transferred to a growth regulator-free ED medium for germination. Histochemical assay of GUS in these plantlets was positive while no activity was observed in non-transgenic control. The integration of the bar gene was confirmed by PCR analysis.