Abordagem proteômica de folhas da cultivar Mundo Novo (Coffea arabica L.) induzida para a resistência à ferrugem

Abstract

O café é um dos mais importantes produtos agrícolas do Brasil, sendo Minas Gerais o estado com maior área de cultivo, representando 54% da área total. No entanto, diversos fatores podem afetar a sua produtividade. A ferrugem alaranjada, causada pelo fungo Hemileia vastatrix é uma das principais doenças do cafeeiro arábica, responsável por até 50% de perdas na produção, se a doença não for controlada. O tratamento com fungicidas tem sido o principal meio de controle desta doença, porém métodos alternativos têm sido desenvolvidos, como os compostos indutores de resistência, para o manejo fitossanitário e sustentável das lavouras. Devido à importância econômica do café, algumas ferramentas biotecnológicas, como a proteômica, têm sido utilizadas para estudar esta cultura. A proteômica de plantas tem sido realizada explorando ao máximo a alta capacidade de resolução e separação das proteínas por eletroforese bi-dimensional (2-DE) em géis de poliacrilamida, seguida de identificação das proteínas por espectrometria de massa (MS). O sucesso desta abordagem depende da qualidade e reprodutibilidade das amostras de proteína extraídas. O objetivo da presente tese foi caracterizar o proteoma de folhas de C. arabica cv. Mundo Novo, e identificar as proteínas que diferiram na abundância após tratamento com os indutores de resistência, GreenForce CuCa e Bion ® , e/ou a infecção com o fungo H. vastatrix. Os extratos proteicos das folhas foram obtidos por precipitação das proteínas em ácido tricloroacético/acetona seguido de um protocolo de purificação otimizado. Após separação das proteínas por 2-DE, os spots polipeptídeos mais abundantes e visíveis foram excisados do gel e a identificação das proteínas foi realizada utilizando a técnica de LC/MS/MS ou MALDI-TOF/TOF- MS.Foram identificadas167 proteínas pertencentes a 55 superfamilias (NCBI), estando envolvidas em diversos processos biológicos nomeadamente; a fotossíntese, metabolismo das proteínas, estresse biótico e abiótico, redox e glicólise entre outros. Destas proteínas 65 mostraram alteração na sua abundância após o tratamento com os indutores de resistência e/ou infecção pela ferrugem. Após a pulverização com GreenForce CuCa, a maioria das proteínas identificadas, foram menos abundante, e as mais abundante estavam envolvidas no metabolismo fotossintético e estresse/defesa. Já no que se refere à pulverização com Bion ® quase a metade foi mais abundante, e estavam envolvidas no metabolismo fotossintético, respiração e estresse. O perfil proteico obtido com o tratamento Bion mostrou-se mais semelhante ao da testemunha do que ao do GreenForce CuCa. Estes são os primeiros resultados obtidos ao nível do proteoma das folhas após tratamento com os indutores de resistência GreenForce CuCa e Bion ® . Os resultados mostraram uma alteração na abundância relativa de proteínas envolvidas no metabolismo energético (fotossíntese e respiração) e estresse/defesa, o que sugere alterações ao nível do metabolismo primário das células após os tratamentos. Estes trabalhos poderão servir de ponto de partida para estudos futuros no que diz respeito à pesquisa de outras proteínas (vias metabólicas) também envolvidas na resistência induzida.Coffee is one of the most important agricultural products from Brazil , mainly in Minas Gerais, where it represents more than 54% of the national production. However, many factors can affect its productivity. Coffee leaf rust caused by the fungus Hemileia vastatrix is a major disease of Arabica coffee can cause losses in productivity up to 50%, if the disease is not controlled. Fungicides are the main control to combat this disease, but alternative methods have been developed, such as inducing compounds resistance to the phytosanitary and sustainable management of crops. Due to the economic importance of coffee, some biotechnological tools such as proteomics, have been used to study this culture. The proteomic of plants has been performed taking full advantage of the high capacity of resolution and separation of proteins by bi-dimensional electrophoresis (2-DE) polyacrylamide gels, followed by identification of proteins by mass spectrometry (MS). The success of this approach depends on the quality and reproducibility of the extracted protein samples. The purpose of this thesis was to characterize leaf proteome of C. arabica cv. Mundo Novo, and identifying the differentially expressed proteins after treatment with the inducing resistance GreenForce CuCa and Bion ® and/or the infection with fungal H. vastatrix. Protein extracts from leaves were obtained by precipitation of the proteins in the trichloroacetic acid/ acetone followed by an optimized purification protocol. After separation of proteins by 2-DE the most abundant and visible polypeptides spots were removed from the gel and the protein identification was accomplished using the technique of LC/MS/MS or MALDI-TOF/TOF-MS. One hundred sixty seven proteins have been identified belonging to 55 super families, and they are involved in several biological processes including; photosynthesis, protein metabolism, biotic and abiotic stress, redox and glycolysis among others. From these proteins 65 showed changes in their abundance after treatment with resistance inducers and/or infection by leaf rust. After spraying with GreenForce CuCa, the majority of the identified proteins were less abundant, and the most abundant were involved in photosynthetic metabolism and stress/defense. Regarding spraying with Bion ® almost half was more abundant, and they were involved in photosynthetic metabolism, respiration, and stress. The protein profile obtained with the Bion treatment was more similar to the control than to the GreenForce Cuca. These are the first results obtained at the level of proteome of the leaves after treatment with the resistance inducers GreenForce CuCa and Bion ® . Results showed a change in the relative abundance of proteins involved in energetic metabolism (photosynthesis and respiration) and stress/defense, suggesting alterations in the level of the primary cells metabolism after treatment. This work may serve as a starting point for future studies regarding research of other proteins (metabolic pathways) also involved in induced resistance.