Bandeamento NOR e coloração com laranja de acridina em cromossomos metafásicos obtidos de agregados celulares de Coffea canephora

Abstract

O gênero Coffea pertence à Família Rubiaceae, e apresenta duas espécies de grande importância econômica: Coffea arabica e Coffea canephora. Coffea canephora apresenta 2n=22 cromossomos, sendo um par de cromossomos metacêntricos (número 1), 10 pares de cromossomos submetacêntricos (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11) e um par de cromossomos que possuem, no braço curto, um satélite associado à constrição secundária (6). Este estudo teve como objetivo aplicar técnicas de bandeamentos em cromossomos metafásicos de C. canephora para verificar se constrição secundária, evidenciada no cromossomo número 6, corresponde à região organizadora do nucléolo (NOR). Agregados celulares em suspensão foram obtidos a partir de explantes foliares de C. canephora. Esses agregados foram cultivados em meio estéril de manutenção, em agitador, com ciclos de 110 rpm, à temperatura ambiente. Para obtenção de cromossomos metafásicos, foram adicionados 125 ml de amiprofos-metil (APM) 0,1 mM para cada 50 ml de meio de cultura, resultando numa concentração final de 3,0 mM. Após 4 h de bloqueio, os agregados foram retirados, fixados em solução de metanol:ácido acético (3:1) e armazenados à -20º C. As preparações citogenéticas foram realizadas pela técnica dissociação celular com digestão enzimática Flaxzym â (NOVO), secagem ao ar e coradas com solução de Giemsa 3%, em tampão fosfato pH 6,8, por 3 min. Algumas lâminas foram descoradas com soluções de metanol:ácido acético (3:1) e armazenadas em estufa a 37 0 C, por 7 dias. Após o período de envelhecimento, as lâminas foram tratadas com tampão fosfato, pH=6,5, a 85º C, por 20 min. Em seguida, foram coradas com solução de laranja de acridina a 0,01%, por 15 min, em câmara úmida, e, posteriormente, lavadas e água destilada por 1 min, 2 min e em tampão fosfato por 3 min. Três gotas de tampão fosfato foram adicionadas entre lâmina e lamínula. A técnica clássica de bandeamento NOR foi realizada gotejando-se solução de AgNO3 50% sobre lâminas não coradas. Logo após, as mesmas foram cobertas com lamínulas e colocadas em câmara úmida a 34º C, por 18 h. Decorrido o tempo de armazenamento, as lamínulas foram retiradas com jatos de água e as lâminas, lavadas em água corrente e destilada por 2 min. As preparações foram observadas com objetiva de imersão (100X) e as figuras cromossômicas capturadas com sistema digital de análise de imagem acoplado ao microscópio. O tratamento com APM possibilitou a obtenção de metáfases com cromossomos morfologicamente definidos, alongados e não sobrepostos, permitindo a montagem do cariograma da espécie. Identificou-se a presença de satélite associado à região da constrição secundária, no braço curto do sexto par de homólogos, sugerindo que esta constrição seja a NOR. A marcação positiva, evidenciada pela técnica de bandeamento NOR (Ag-NOR), confirmou que está região é a NOR. A coloração com laranja de acridina revelou uma fluorescência mais intensa nas regiões flanqueadoras da NOR, indicando que estas regiões são heterocromáticas ricas em GC. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que a constrição secundária do cromossomo número 6 corresponde à NOR, evidenciada pela técnica Ag-NOR, e que esta região também pode ser identificada pela coloração com laranja de acridina.