Crescimento e caracterização de pectina liase de Paenibacillus amylolyticus isolado de fruto de café (Coffea arabica L.)

Abstract

A bactéria Paenibacillus amylolyticus, isolada de frutos de café que tiveram sua superfície devidamente desinfestada, foi cultivada em frascos Erlenmeyer de 125 mL, com 50 mL de volume de trabalho, em meio mineral suplementado com extrato de levedura 0,06% (p/v), com diferentes fontes de carbono, sempre a 0,3% (p/v) e pH 7,0, sendo a cultura incubada a 25oC, com agitação de 150 rpm ou sem agitação. A bactéria também apresentou crescimento quando o extrato de levedura foi substituído por tiamina 50 mg L-1 e outras vitaminas do complexo B, mas nunca quando alguns desses fatores não eram adicionados ao meio mineral. Paenibacillus amylolyticus cresce na ausência de sulfato de amônio, desde que extrato de levedura 0,06% (p/v) esteja presente, porém o mesmo não se verifica quando se substitui o extrato de levedura por tiamina 50 mg L-1. O microrganismo não foi capaz de crescer em anaerobiose provocada pelo borbulhamento de nitrogênio gasoso, tanto na presença quanto na ausência de sulfato de amônio, indicando que tal bactéria não é capaz de crescer em anaerobiose e fixar nitrogênio nessa condição. P. amylolyticus é capaz de crescer em pectina como única fonte de carbono e, para tal, produz pectina liase (PL), para lise deste carboidrato. A enzima PL acumula-se no meio mais eficientemente após 24 horas de crescimento, apresentando maior especificidade por pectina cítrica, quando utilizada como substrato enzimático. A atividade ótima de PL ocorre a 40oC e a termoestabilidade, até 45oC. Entre os valores de pH avaliados, PL apresentou atividade entre pH 5,6 e 8,6, sendo o ótimo 7,9. A adição de EDTA e íons metálicos na mistura de reação mostrou pequeno efeito na atividade da enzima, e os valores de Km e Vmax aparentes foram, respectivamente, de 6,61 mg mL-1 e 1,24 x 10-7 mol min-1 mL-1.The bacterium Paenibacillus amylolyticus, isolated from surface-sterilized coffee beans, was cultured at 25oC, with and without agitation, in 125 mL shaker flasks containing 50 mL of mineral media (pH 7.0) supplemented with yeast extract 0.06% (w/v) and different carbon sources at a concentration of 0.3% (w/v). P. amylolyticus also showed growth when yeast extract was replaced with thiamin 50 mg L -1 and other B complex vitamins, but no growth was detected when one of these substances was not added to the media. This bacterium grows in absence of ammonium sulfate when yeast extract 0.06% (w/v) is added, although growth is not detected when yeast extract is replaced with thiamin 50 mg L-1. When submitted to an anaerobic environment, through of addition of gas nitrogen, no growth was verified in a medium with and without fixed nitrogen, indicating that this organism is not capable of fixing gas nitrogen. P. amylolyticus is capable of using pectin as a sole carbon source, a result that indicates production of pectin liase (PL). The production of this enzyme is detected in higher concentrations after 24 hours of growth, showing an increased affinity, or specificity , for citric pectin when this is used as the enzymatic substrate. Optimum activity for PL occurs at 40oC and is thermostable for up to 45oC. PL shows activity between pH values of 5.6 and 8.6, although pH 7.9 is best. Addition of EDTA and metal ions to the reaction mixture present a small effect in enzyme activity, and the Km and Vmax values are 6.61 mg mL-1 and 1.24 x 10-7 mol min-1 mL-1, respectively.