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Comparação da microbiota da superfície de frutos de café (Coffea arabica L.) colhidos em duas localidades
(2000) Paula, Evandro Marcus de; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Pitta, Otávio P. L.; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A expressão final da qualidade da bebida do café é o resultado de um conjunto complexo de interação de fatores bióticos e abióticos, entre os quais se destaca a microbiota presente nos frutos durante os vários estádios de maturação. Este trabalho objetivou quantificar e caracterizar quanto à morfologia as populações microbianas encontradas na superfície dos frutos durante quatro estádios de desenvolvimento. As amostras de frutos de café arábica ‘Catuai Vermelho’ nos estádios verde, verde-cana, cereja e passa foram coletadas em Viçosa, MG, e Serra do Salitre, MG. Os grãos foram desinfestação individualmente para se determinar o número de células viáveis pela técnica de contagem de colônias em placas de Petri. A seguir foi feito o isolamento de microrganismos, a partir de colônias morfologicamente distintas, em cada uma das placas. Foram isolados 141 culturas a partir dos grãos amostrados em Viçosa, 85% delas sendo de bactérias, 10% de leveduras e 4% de fungos filamentosos. Diferentemente, de um total de 268 culturas provenientes dos isolados de Serra do Salitre, 94% foram bactérias, 2,5% leveduras e 3,5% fungos filamentosos. Nesta localidade, a diversidade de tipos morfológicos foi maior. Foi constatada a ocorrência da sucessão microbiana, a qual é evidente nos estádios cereja e passa. As culturas de bactérias, fungos filamentosos e leveduras provenientes das duas localidades foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para futuros estudos de biotecnológicos.
Diversidade de bactérias endofíticas em frutos de café
(Universidade Federal de Viçosa, 2008) Cordero, Alexander Francisco Perez; Borges, Arnaldo Chaer; Universidade Federal de Viçosa
O objetivo do presente trabalho foi estudar a diversidade de bactérias endofíticas associadas aos frutos em quatro cultivares de Coffea arabica L., em diferentes altitudes na Zona da Mata Norte, Minas Gerais, Brasil. As amostras de frutos sadios, no estádio cereja, foram coletadas em lavouras de Catuaí Amarelo, Catuaí Vermelho, Bourbon Amarelo e Bourbon Vermelho. O isolamento e a quantificação de bactérias dos frutos foram realizados em meio de cultura R2A, estabelecendo-se uma coleção de culturas de bactérias endofíticas e epifíticas de frutos de café no Laboratório de Ecologia Microbiana (LEM) do Departamento de Microbiologia com 381 isolados, dos quais 134 de endofíticas. Entre essas foram identificados e descritos 48 morfotipos, que constituíram o universo-base para o presente estudo. A identificação fenotípica foi por características culturais e análises de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME) pelo sistema de identificação Sherlock®(MIDI). O estudo das endofíticas cultiváveis foi realizado com dados do seqüenciamento direto de amplicons obtidos por PCR, enquanto que para o das não-cultiváveis foram utilizados primer específicos para grupos de bactérias de três filos, Proteobacteria classes, [alfa], [Beta] e y, Firmicutes e Actinobacteria, sendo os produtos do Nested-PCR analisados por eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE). Nas amostras de café cereja a altitudes entre 676 até 1.187 m, as densidades de endofíticas variaram, em UFC.fruto-1, de 2,93 x 104 a 6,2 x 106 em Catuaí Amarelo; 7,6 x 104 a 6,0 x 106 em Catuaí Vermelho; 1,24 x 104 a 1,35 x 106 em Bourbon Amarelo e 4,6 x 104 a 2,69 x 106 em Bourbon Vermelho. As médias de densidades populacionais de bactérias endofíticas, em relação a cultivares e à altitude, diferiram (p<0,05) entre si. Os maiores valores das médias a altitudes superiores a 1.000 m, em Catuaí Vermelho e Bourbon Vermelho, diferiram (p<0,05) das de Catuaí, Amarelo e Vermelho à 676 m . A correlação simples por Pearson mostrou relação positiva (p<0,05) entre as contagens e altitude. As endofíticas cultiváveis foram identificadas com base no perfil FAME/MIDI como sendo de isolados de Curtubacterium flaccumfaciens betae/oortii (LEM CA16, LEM CV20, LEM CA25 e LEM CA28), Brevibacterium epidermis/oidium (LEM BV41), Microbacterium barkeri (LEM CA26 e LEM BV37), Microbacterium luteolum (LEM CA01), Pectinobacterium carotovorum/carotovorum (LEM CA30, LEM CV35, LEM BV38, LEM BA43 e LEM BA45), Pseudomonas putida biótipo A (LEM BA47), Salmonella typhymurium GC grupo B (LEM CV19), Staphylococcus simulans (LEM CV23) e Bacillus sp. (LEM CV24). A análise filogenética com uso de seqüências de rDNA 16S mostrou, para o isolado LEM CV24 uma maior identidade com Bacillus niacini AJ21160.1, enquanto o LEM BV39 correspondeu a Enterobacter amnigenus EU340927.1, e os isolados LEM CA01 e BV37 a Microbacterium sp. Das bactérias endofíticas associadas a cultivares de café, P. carotovorum/carotovorum, S. typhymurium, B. epidermis/oidium, S. simulans, B. niacini e E. amnigenus, são relatadas pela primeira vez como endofíticas em frutos de cafeeiros arábica. As análises de diversidade de bactérias totais, endofíticas e epifíticas, por PCR-DGGE utilizando o primer universal (F948GC/R1378), revelaram a presença de 80 unidades taxonômicas operacionais (UTOs), enquanto a riqueza de endofíticas correspondeu a 64 UTOs. Entretanto, com a utilização de grupos de primer específicos, Nested-PCR, a diversidade de bactérias endofíticas correspondeu a uma riqueza de 110 UTOS para o filo Firmicutes, 71 para y-Proteobacteria e 50 UTOs para Actinobacteria. A constatação da existência de diversidade de endofíticas em C. arábica evidencia a urgência de estudos funcionais desta microbiota, especialmente com relação a compostos precursores de aroma, sabor e acidez, de interesse para produção comercial de cafés de qualidade superior.
Diversidade de bactérias endofíticas em frutos de Coffea canephora em três estádios de maturação
(Universidade Federal de Viçosa, 2011-02-21) Miguel, Paulo Sérgio Balbino; Borges, Arnaldo Chaer
Bactérias endofíticas em frutos são as que habitam partes internas sem causar danos ou sintomas aparentes. Entretanto, a presença e diversidade delas em frutos de Coffea canephora não foram ainda relatadas na literatura. Assim, o presente trabalho objetivou determinar a existência e diversidade de bactérias endofíticas cultiváveis nos frutos dessa espécie em três estádios de maturação. O isolamento e a quantificação foram realizados em meio R2A, sendo obtidos 140 isolados que, pelas características morfológicas das colônias, foram agrupadas em 21 morfotipos, sendo 55 % de Gram-positivas. Na comunidade foram identificadas representantes de Actinobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes, Alpha- e Gamma-Proteobacteria, com 14 gêneros e 18 espécies. Kocuria turfanensis e Pantoea vagans são pela primeira vez identificadas como espécies endofíticas. Sete das 18 espécies identificadas como endofíticas em frutos de C. canephora não são espécies descritas como endofíticas em frutos, a saber: Bacillus thuringiensis, Bacillus licheniformis, Agrobacterium tumefaciens, Escherichia coli, Enterobacter hormaechei, Chryseobacterium sp. e Ochrobactrum sp.. A diversidade das bactérias endofíticas cultiváveis mostrou-se distinta nos três estádios de maturação de frutos de C. canephora, sendo maior nos frutos verdes, nos quais a predominância foi de Bacillus subtilis. Nos dois primeiros estádios de desenvolvimento o número de isolados de Gram-positivas foi maior que o de Gram-negativas, enquanto nos frutos maduros o número de colônias de Gram-positivas e Gram-negativas foi similar. No último estádio de maturação a diversidade de espécies de bactérias endofíticas foi menor e a Klebsiella oxytoca foi a espécie dominante, fato atribuído a prováveis efeitos da maior concentração de cafeína e açúcares nos frutos.
Diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja (Coffea arabica L.) e sucessão durante a seca natural
(Universidade Federal de Viçosa, 2009) Vale, Helson Mário Martins do; Borges, Arnaldo Chaer; Universidade Federal de Viçosa
A diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja das cultivares Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Vermelho e Bourbon Amarelo em lavouras situadas a diferentes altitudes na Zona da Mata Norte em Minas Gerais, Brasil, foi estudada por metodologias dependentes e independentes de cultivo. A densidade de leveduras epifíticas e endofíticas em frutos de café é variável, menos de 25 UFC.fruto-1 a 6,5 x 104 UFC.fruto-1. As 36 leveduras isoladas foram agrupadas em doze morfotipos e a árvore filogenética reconstruída com dados de sequências de bases de rDNA 26S mostrou o agrupamento com as sequências de Candida smithsonii, Pichia guilliermondii, Cryptococcus flavescens, Meira geulakonigii, Pseudozyma sp e Sporobolomyces sp., já depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI). O isolado LEM 647-9, proveniente de Bourbon Vermelho, 1101 m, foi o único com identidade correspondente a Meira geulakonigii, um fungo yeast-like classificado em Ustilaginales, a mesma ordem de Pseudozyma. A ocorrência de um só morfotipo de leveduras endofíticas cultiváveis em Malt yeast glucose peptone medium (MYGP), contendo cloranfenicol, em apenas 4 amostras de café cereja é considerada baixa. As endofíticas foram identificadas com base no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), pelo sistema de identificação Sherlock® (MIDI), e por análise filogenética de sequências de rDNA 26S. As sequencias parciais de rDNA destes isolados mostraram identidade entre 96 e 100 % com as correspondentes a Candida, Pichia e Brettanomyces. Pela análise filogenética a maior identidade foi com Candida e Pichia. A constatação de C. diddensiae P. guilliermondii e C. parapsilosis como endofíticas em frutos de café sadios no estádio cereja se configura como relato novo sobre nicho de ocorrência das espécies. Clones de uma biblioteca de rDNA 26S obtida por amplificação de DNA metagenômico de frutos cereja da C.Vermelho, coletada a 1189 m, foram sequenciados. Doze clones mostraram 98-99% de identidade com rDNAs de fungos filamentosos. Estes correspondem a Mycosphaerella, Glomerella, Microdiplodia e Phaeophaeria e a alguns fungos filamentosos potencialmente endofíticos e ainda não identificados, cujas sequências estão presentes no GenBank. A DGGE da sucessão de leveduras associadas aos grãos de C. arabica durante os 14 dias do período de secagem natural no terreiro de cimento revelou UTOs dominantes já nos 4 primeiros dias. A análise com o programa GelCompar II® demonstrou que o perfil de UTOs da comunidade é alterado a cada dois dias, até o 12º dia de secagem. A determinação de ocorrência e diversidade de leveduras endofíticas nos frutos de café cereja se constitui em etapa fundamental para identificar a síntese de metabólitos produzidos por esses microrganismos e para desenvolver processo biotecnológico que assegure a qualidade superior da bebida do café.
Diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja (Coffea arabica L.) e sucessão durante a seca natural
(Universidade Federal de Viçosa, 2009-05-08) Vale, Helson Mário Martins do; Borges, Arnaldo Chaer
A diversidade de leveduras endofíticas e epifíticas em frutos de café cereja das cultivares Catuaí Vermelho, Catuaí Amarelo, Bourbon Vermelho e Bourbon Amarelo em lavouras situadas a diferentes altitudes na Zona da Mata Norte em Minas Gerais, Brasil, foi estudada por metodologias dependentes e independentes de cultivo. A densidade de leveduras epifíticas e endofíticas em frutos de café é variável, menos de 25 UFC.fruto -1 a 6,5 x 10 4 UFC.fruto -1 . As 36 leveduras isoladas foram agrupadas em doze morfotipos e a árvore filogenética reconstruída com dados de sequências de bases de rDNA 26S mostrou o agrupamento com as sequências de Candida smithsonii, Pichia guilliermondii, Cryptococcus flavescens, Meira geulakonigii, Pseudozyma sp e Sporobolomyces sp., já depositadas no National Center for Biotechnology Information (NCBI). O isolado LEM 647-9, proveniente de Bourbon Vermelho, 1101 m, foi o único com identidade correspondente a Meira geulakonigii, um fungo yeast-like classificado em Ustilaginales, a mesma ordem de Pseudozyma. A ocorrência de um só morfotipo de leveduras endofíticas cultiváveis em Malt yeast glucose peptone medium (MYGP), contendo cloranfenicol, em apenas 4 amostras de café cereja é considerada baixa. As endofíticas foram identificadas com base no perfil de ésteres metílicos de ácidos graxos (FAME), pelo sistema de identificação Sherlock ® (MIDI), e por análise filogenética de sequências de rDNA 26S. As sequencias parciais de rDNA destes isolados mostraram identidade entre 96 e 100 % com as correspondentes a Candida, Pichia e Brettanomyces. Pela análise filogenética a maior identidade foi com Candida e Pichia. A constatação de C. diddensiae P. guilliermondii e C. parapsilosis como endofíticas em frutos de café sadios no estádio cereja se configura como relato novo sobre nicho de ocorrência das espécies. Clones de uma biblioteca de rDNA 26S obtida por amplificação de DNA metagenômico de frutos cereja da C.Vermelho, coletada a 1189 m, foram sequenciados. Doze clones mostraram 98-99% de identidade com rDNAs de fungos filamentosos. Estes correspondem a Mycosphaerella, Glomerella, Microdiplodia e Phaeophaeria e a alguns fungos filamentosos potencialmente endofíticos e ainda não identificados, cujas sequências estão presentes no GenBank. A DGGE da sucessão de leveduras associadas aos grãos de C. arabica durante os 14 dias do período de secagem natural no terreiro de cimento revelou UTOs dominantes já nos 4 primeiros dias. A análise com o programa GelCompar II ® demonstrou que o perfil de UTOs da comunidade é alterado a cada dois dias, até o 12o dia de secagem. A determinação de ocorrência e diversidade de leveduras endofíticas nos frutos de café cereja se constitui em etapa fundamental para identificar a síntese de metabólitos produzidos por esses microrganismos e para desenvolver processo biotecnológico que assegure a qualidade superior da bebida do café.
Diversidade genética de bactérias endofíticas associadas a frutos de café (Coffea arabica L.)
(Universidade Federal de Viçosa, 2008-08-22) Santos, Thiago Monteiro Araújo dos; Borges, Arnaldo Chaer
A complexidade da microbiota epifítica e endofítica presente em frutos de café e o limitado conhecimento dos microrganismos, especialmente dos não- cultiváveis, dificultam a caracterização da microbiodiversidade e da possível atividade e contribuição dela para a formação de precursores de compostos que definem a qualidade superior da bebida do café. O presente estudo teve como objetivo avaliar a diversidade bacteriana endofítica associada aos frutos de café (Coffea arabica L.) coletados em fazenda localizada na Zona da Mata Norte de Minas Gerais, Brasil. Fragmentos de rDNAs 16S foram diretamente amplificados por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) a partir de primers específicos para os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria pertencentes às classes α, β e γ, utilizando, como molde, DNA metagenômico extraído de frutos de café. Os amplicons foram submetidos à Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) e utilizados para construção de bibliotecas de clones de rDNAs 16S. A PCR-DGGE mostrou variado perfil de diversidade genética na amostra de DNA, com a presença de pelo menos 38 Unidades Taxonômicas Operacionais (UTOs). Os produtos de PCR purificados e seqüenciados mostraram que a comunidade de bactérias endofíticas é composta, entre outros, por representantes relacionados filogeneticamente aos filos Firmicutes e Proteobacteria pertencentes às classes β e γ, dentre os quais se destacam microrganismos cultiváveis e não-cultiváveis. A presença de bactérias endofíticas pertencentes ao gênero Burkholderia e à espécie Klebsiela oxytoca é sugerida com base nas análises filogenéticas realizadas a partir do seqüenciamento de DNA obtido de bandas purificadas do gel de DGGE. Um total de 50 clones positivos da biblioteca de rDNAs 16S de γ-Proteobacteria endofíticas e 25 clones positivos da biblioteca de rDNAs 16S de Firmicutes endofíticos foram parcialmente seqüenciados e identificados. O resultado da análise das seqüências mostrou 3 gêneros de Firmicutes na biblioteca de rDNAs 16S, sendo que 60% mostraram alta identidade com Bacillus, 8% com Staphylococcus e 4% com Paenibacillus. Análises de rarefação e de cobertura mostraram que a biblioteca foi representativa e suficiente para refletir a diversidade de Firmicutes endofíticos de frutos de café e que a seqüência única detectada na amostra aproxima-se do número total de seqüências únicas dentro desta biblioteca. As populações de bactérias endofíticas presentes em frutos de café são diversas e compreendem diferentes filos. Neste estudo foi construída, pela primeira vez, uma biblioteca de clones de rDNAs 16S para acessar a diversidade de bactérias endofíticas, cultiváveis e não-cultiváveis, em frutos de café. O papel funcional dessas bactérias nos frutos de café, assim como a diversidade genética e funcional de outros grupos de microrganismos, continua sendo investigado. O conhecimento dessa diversidade é de fundamental importância para se determinar a participação destes microrganismos na produção e interconversão de metabólitos precursores daqueles que estão associados à qualidade superior da bebida do café. Adicionalmente, esses estudos podem auxiliar no entendimento dos princípios fisiológicos e genéticos envolvidos nas complexas interações microrganismo- hospedeiro e microrganismo-microrganismo.
Microbiota endofítica em frutos de Coffea arabica L.
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Paula, Evandro Marcus de; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Hara, André; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Os microrganismos estão intimamente associados a plantas, podendo colonizar os tecidos vegetais internos (microbiota endofítica) e a superfície de órgãos (microbiota epifítica). No preparo via seca do café, a fermentação ocorre na massa de frutos colhidos em diferentes estádios de desenvolvimento. Embora existam vários estudos mostrando que bactérias e leveduras participam desse processo fermentativo, a microbiota endofítica, presente nos frutos de café antes da colheita, tem sido pouco caracterizada. Os objetivos do presente trabalho foram quantificar e caracterizar morfologicamente a microbiota endofítica que coloniza frutos sadios de café arábica em diferentes estádios de desenvolvimento, antes da colheita. Os frutos foram amostrados em Viçosa em intervalos de 15 dias, nos seguintes estádios de desenvolvimento: chumbinho-pequeno, chumbinho-médio, verde, verde-cana, cereja e passa. Em Serra do Salitre e em Patrocínio foi realizada apenas uma amostragem de cada localidade, dos estádios verde, verde-cana, cereja e passa. Em cada estádio foram coletados 24 frutos sadios de 12 plantas (dois frutos sadios de cada planta). Em Viçosa, o procedimento foi repetido utilizando-se outras 12 plantas da mesma lavoura. Os frutos, após esterilização superficial com etanol 70% e hipoclorito de sódio a 5%, foram triturados sob condições assépticas. O material triturado foi utilizado para quantificação e isolamento da microbiota endofítica. A determinação do número de células viáveis foi realizada pela contagem de colônias em placas, em meio R2A. Os microrganismos endofíticos foram isolados a partir das placas de cada amostragem. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi transferida para nova placa de meio R2A, para obtenção de culturas puras. As características morfológicas dos isolados foram determinadas pela coloração de Gram. As populações potencialmente endofíticas encontradas nos diferentes estádios de desenvolvimento dos frutos variaram de 10 2 a 10 4 UFC/g de peso fresco do fruto, nas três localidades. Foram obtidas populações endofíticas a partir de frutos no estádio passa somente em Serra do Salitre. Em um total de 282 isolados obtidos em Viçosa, as bactérias representaram aproximadamente 84%, as leveduras 7% e os fungos filamentosos 9%. Em Serra do Salitre foram obtidos apenas isolados bacterianos (bastonetes Gram positivos e Gram negativos). Em Patrocínio, foram obtidas bactérias e leveduras, mas não fungos filamentosos. Entre os isolados bacterianos endofíticos das três localidades, os bastonetes predominaram sobre os cocos. Dentre os bastonetes, as bactérias Gram negativas foram isoladas em maior número. Todas as culturas potencialmente endofíticas foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para posterior identificação e futuros estudos biotecnológicos.
Sucessão bacteriana durante o desenvolvimento de frutos de café (Coffea arabica L.)
(Universidade Federal de Viçosa, 2010-08-19) Pontes Júnior, Maurício Duarte; Borges, Arnaldo Chaer
Neste trabalho foi estudada a diversidade de bactérias endofíticas associadas a frutos de Coffea arabica L. durante o seu desenvolvimento. Foram realizadas sete coletas mensais, acompanhando o desenvolvimento dos frutos em cafeeiros de um talhão homogêneo de lavoura do cultivar Catuaí Vermelho. Cada amostra foi processada seguindo protocolo para obter o DNA total da comunidade bacteriana endofítica, associada a cada estádio de desenvolvimento do fruto. Foi empregada a estratégia de amplificação do rDNA16S pela técnica de Nested-PCR e discriminação em DGGE. A população total de bactérias endofíticas e os filos Actinobacteria, Firmicutes e Proteobacteria (classes alfa, beta e gama) foram investigados. A análise de cada gel, representando a evolução de uma população ao longo do tempo, foi realizada empregando o programa Bionumerics ® . Demonstrou-se a existência de populações de bactérias endofíticas associadas aos frutos de café desde o primeiro mês de seu desenvolvimento, com emprego do primer universal para Eubacteria. Pela maior similaridade entre o padrão de distribuição das UTOs nas raias que representam os dois meses finais de desenvolvimento dos frutos inferiu-se que as populações tendem para a estabilização. A menor similaridade entre as populações endofíticas, presentes nas diferentes fases de desenvolvimento dos frutos, foi constatada no filo Firmicutes, enquanto as beta- Proteobacteria exibiram maior similaridade entre as diferentes fases de desenvolvimento dos frutos. A amplificação do rDNA por Nested PCR e discriminação em DGGE mostrou-se adequada para a distinção da dinâmica de alterações nas populações entre os filos e as classes de bactérias estudadas.