Navegando por Autor "Pereira, Luiz Filipe Protasio"

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Açúcares solúveis, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase durante o desenvolvimento do fruto de café, sob diferentes condições de luz e carga
(2007) Geromel, Clara; Mazzafera, Paulo; Marraccini, Pierre Roger Rene; Ferreira, Lucia Pires; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Embrapa - Café
Foram abordados nesse trabalho aspectos fisiológicos de carboidratos envolvidos na relação fonte-dreno, sendo a sacarose o principal carboidrato exportado. Sabendo-se que a sacarose não é utilizada diretamente como substrato para a maioria dos processos envolvidos no crescimento, desenvolvimento e armazenamento, tanto na fonte como no dreno, o destino metabólico da sacarose é mediado pelas enzimas invertases, sacarose sintase e sacarose fosfato sintase. Nesse estudo foram dosadas as enzimas sintase da sacarose (SUSY) e sacarose fosfato sintase (SPS), assim como os teores de açúcares solúveis totais, redutores e sacarose, durante o desenvolvimento do fruto de cafeeiro em diferentes tecidos: polpa, perisperma e endosperma e em diferentes condições de tratamento: controle, onde as plantas foram expostas a pleno sol; com sombrite 50% e com carga do cafeeiro reduzida à 30%. Foi mostrado que, apesar de SUSY e SPS tenderem a ter menor atividade nos tratamentos de sol e menor produção, os teores de açúcares não variaram. Foi observado que as enzimas seguem o mesmo padrão de atividade em todos os tecidos aumentando com a maturação, independente do tratamento.
Adaptação de acessos de Coffea arabica provenientes de camarões em várias condições edafoclimáticas
(Embrapa Café, 2015) Charmetant, Pierre; Perthuis, Bernard; Bedimo, Joseph Mouen; Manga, Amougou Mbarga; Guerra, Antonio Fernando; Bartholo, Gabriel Ferreira; Rocha, Omar Cruz; Leroy, Thierry; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho; Marraccini, Pierre
O objetivo desse trabalho foi caracterizar recursos genéticos de Coffea arabica - acessos selvagens e cultivares - oriundo da África visando sua utilização no melhoramento. Os acessos provenientes de Camarões têm dados acumulados de mais de 30 anos. Oito acessos foram introduzidos em 2010 na Guiana Francesa e no Brasil para experimentação. No Brasil, depois de um período de quarentena, foram plantados ensaios no centro Cerrados da Embrapa e no IAPAR, além da Guiana Francesa Analisamos dados de crescimento, de ramificação secundária, de adaptação fisiológica à seca, para escolher genitores de cruzamentos com cultivares locais. Híbridos F1 estão sendo avaliados para selecionar os com melhor adaptação à evolução das condições climáticas.
Análise de genes expressos durante estádios finais da maturação de frutos de café
(2005) Budzinski, Ilara G. F.; Cação, Sandra M. B.; Carneiro, Cristine E.A.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A maturação uniforme dos frutos do cafeeiro relaciona-se diretamente com a qualidade da bebida. Diferentes floradas em um mesmo cafeeiro propiciam frutos em estádios desiguais de maturação podendo resultar em uma maior dificuldade na colheita, maior gasto com mão de obra e queda na qualidade do produto. Em frutos climatéricos, o processo final da maturação é desencadeado por um grande acúmulo de etileno, seguido por mudança bioquímicas e fisiológicas que promovem principalmente a desestabilização da parede celular dos frutos, composta principalmente por compostos pécticos. As pectinas são degradadas devido à solubilização e despolimerização da parede celular vegetal em decorrência da ação de enzimas como: pectinametilesterase, poligalacturonase, xiloglucanases, xilanases, pectinaliases e [Beta]-galactosidases. Nosso objetivo principal é caracterizar e entender as mudanças na expressão gênica e enzimática que ocorrem durante a maturação dos frutos de café, visando melhorar a uniformidade da maturação. Neste trabalho foram feitos estudos de expressão de genes que codificam para ACC oxidase, expansina, pectinametilesterase e poligalacturonases, através da análise "in silico" do banco de dados do Projeto Genoma Café, e experimentos de expressão dos genes e enzimas. Análise de transcritos demonstrou um aumento de ACC oxidase em frutos verde-cana seguido da atividade de pectinametilesterases em estágios intermediários de maturação (frutos avermelhados). A atividade da PG foi detectada nos estádios finais de maturação, principalmente em frutos cereja.
Análise in silico de pectinametilesterases de Coffea spp.
(2007) Leite, Thiago Falda; Budzinski, Ilara G. F.; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A maturação desuniforme dos frutos do cafeeiro, associada a práticas inadequadas de colheita e pós-colheita, pode prejudicar a qualidade final do café. Visando compreender melhor os genes envolvidos na maturação de frutos do cafeeiro foram iniciados estudos in silico e in vivo da atividade da pectinametilesterase (PME-EC 3.2.1.11). A PME é a enzima responsável por catalisar a desmetilação de ésteres metílicos dos ácidos poligalacturônicos e se encontra distribuída em raízes, caules, folhas e frutos da grande maioria das plantas superiores. Essa enzima tem um importante papel no amaciamento de frutos pelo aumento da susceptibilidade das pectinas a poligalacturonase (PG) durante o amadurecimento. A análise in silico foi realizada através de buscas no banco de dados disponibilizados pelo projeto Genoma Café, assim como de outros bancos de domínio público. Foram identificados inicialmente 31 contigs, mas apenas oito destes apresentavam seqüências provenientes de bibliotecas de frutos de café. Comparação dos contigs obtidos nos bancos de dados do Genoma Café e do HarvEST Coffea, permitiu a caracterização in silico da expressão de alguns dos contigs nos diferentes estágios de maturação dos frutos. Análise da expressão in vivo destes contigs está sendo realizada para validação dos dados obtidos in silico.
Análise in silico e in vivo da via de isoprenóides em café
(2007) Tiski, Iris; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Pot, David; Marraccini, Pierre Roger Rene; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
Os diterpenos cafestol e caveol, presentes na fração lipídica em grãos de café, originam-se da via de síntese de isoprenóides. Estes compostos são sintetizados em todos os organismos, sendo abundantes em plantas com cerca de 10 mil componentes relatados. Apesar da diversidade de funções e estruturas todos os isoprenóides derivam de cinco comuns átomos de carbono, o isopentenil difosfato (IPP) e do isômero dimetilalil difosfato (DMAPP). Em vegetais superiores, duas vias localizadas em compartimentos intracelulares separados estão envolvidas na biossíntese de IPP e DMAPP. No citosol, IPP é derivado da via do ácido mevalônico (MVA) e no plastídeo, IPP é formado pela via do metileritritol fosfato (MEP ou não mevalonato). Com a disponibilidade das seqüências dos genes expressos (ESTs) pelo Projeto Genoma Café tornou-se possível a identificação in silico e o estudo funcional dos genes que codificam para as enzimas 3-hidroxi-3metilglutaril-CoA reductoisomerase (HMGR) e mevalonato difosfato decarboxilase (MPDC) para a via MVA e 1-deoxi-D-xilulose 5-fosfato reductoisomerase (DXR) e isopentenil difosfato sintase (IDS) para a via MEP. Foram obtidas 13 ESTs de HMGR, que originaram três contigs incompletos, resultando em duas isoformas. Para o gene MPDC foram encontradas 7 ESTs que clusterizaram em somente uma isoforma, diferentemente de A. thaliana onde duas isoformas são encontradas. Para os genes da via MEP foram encontrados 22 ESTs para DXR e 47 ESTs para IDS que formaram apenas um contig para cada um destes genes. Southern blots dos genes HMGR e DXR também demonstraram a presença de duas isoformas para HMGR e uma para DXR em C. arabica. Análise da expressão por Northern blots detectou transcritos do gene DXR no começo de desenvolvimento do perisperma e nas fases finais de desenvolvimento de endosperma e polpa. Transcritos da isoforma HMGR2 foram detectados em polpa, perisperma e endosperma, em todas as fases de desenvolvimento do fruto. Entretanto, HMGR1 apresentou transcritos apenas em polpa e fase inicial do desenvolvimento de perisperma e endosperma.
Análise proteômica do estresse hídrico em cafeeiro
(2007) Ramos, Humberto J.O.; Chaves, Daniela F.S.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Cruz, Leonardo M.; Fungaro, Maria H.; Hungria, Mariângela; Osaku, Clarice; Petzl-Erler, Maria L.; Ayub, Ricardo Antônio; Peralta, Rosane M.; Marur, Celso Jamil; Souza, Emanuel M.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pedrosa, Fábio O.; Embrapa - Café
Déficit hídrico é um dos fatores ambientais mais importantes para a diminuição da produtividade do cafeeiro, tanto no Brasil quanto em outros países produtores. O estabelecimento de estratégias para obtenção de cultivares tolerantes ao estresse hídrico depende da compreensão das respostas biológicas ao nível genético, molecular e bioquímico. Para estudar a resposta ao estresse hídrico no gênero Coffea, foi estabelecida uma rede de pesquisa em proteômica (PROTEOPAR - Programa Proteoma do Paraná) constituída de oito laboratórios. Quatro genótipos de Coffea, com diferentes respostas fisiológicas à seca, foram analisados: C. canephora (Clone 14, tolerante e Clone 109A, sensível) e C. arabica (BA10, tolerante e Geisha, sensível). Proteínas foram extraídas de folhas e raízes de plantas (18 meses de idade) mantidas em casa-de-vegetação, utilizando-se o método de SDS-Fenol modificado. Os regimes hídricos constituíram-se dos seguintes tratamentos: controle irrigado, estresse hídrico severo (-4,0 MPa de potencial de água) e recuperação pós-estresse (36 horas após irrigação). Os extratos protéicos foram distribuídos aos laboratórios do PROTEOPAR para obtenção e análise do padrão de expressão protéica diferencial via eletroforese bidimensional. O método de identificação de proteínas PMF ("Peptide mass fingerprinting") foi aplicado utilizando-se um espectrômetro de massa (MS) do tipo MALDI-TOF e comparando os espectros de digestão tríptica contra bancos de dados baseados em ESTs de Coffea.
Assisted selection using molecular markers linked to rust resistance SH3 gene in Coffea arabica
(Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2023-10-25) Silva, Angelita Garbossi; Ariyoshi, Caroline; Shigueoka, Luciana Harumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Sera, Gustavo Hiroshi
The aim of this work was to validate markers linked to the SH3 gene of coffee leaf rust (CLR) resistance and use them in assisted selection. Initially, we validated the markers in genotypes already known to carry SH3. Next, we performed phenotype and genotype evaluation for resistance to CLR in coffee plants growing under field conditions. We used Arabica coffee progenies derived from BA-10, which carries the SH3 gene due to introgression of C. liberica. Three SCAR markers (SP-M16-SH3, BA-48-21O-f, and BA-124-12K-f) and one SSR marker (Sat244) linked to SH3 gene were used to amplify the coffee plants’ DNA. Our assessments of markers validation in resistant genotypes, SP-M16-SH3 and BA-124-12K-f, were efficient to identify the SH3 gene. These two markers were used to evaluate the progenies derived from BA-10 and were significantly linked to the phenotype evaluations. The SP-M16-SH3 marker was more efficient, with the advantage of being codominant.
Caracterização de promotores de Coffea spp. via transformação genética em planta modelo
(Embrapa Café, 2019-10) Girotto, Larissa; Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryoshi, Caroline; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe Protasio
As mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, e apresentam o potencial de reduzir áreas disponíveis para o plantio de cafeeiros. Diante deste cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre principalmente em resposta a estresses abióticos. Entender a estrutura e composição de sequências gênicas promotoras de cafeeiros é de fundamental importância para compreender melhor os mecanismos genéticos e os processos de regulação da expressão gênica induzidos em períodos de estresse hídrico e salino. Neste estudo identificamos 14 promotores GolS presentes nos genomas de Coffea arabica, C. canephora e C. eugenioides. Dentro das regiões promotoras desses genes, foram observados 12 cis-elementos relacionados a regulação de genes em resposta a condições adversas, dentre eles: ARE, ABRE, MYB e STRE. Após a caracterização in silico dos 14 promotores, o promotor da isoforma de GolS3 (CcGolS3) de Coffea canephora (Cc) foi clonada com o objetivo de verificar o seu comportamento frente a estresses abióticos. Plasmídeos contendo a construção pCcGolS3::GUS (gene repórter da β-glucuronidase) foram inseridos em Arabidopsis thaliana via transformação genética com Agrobacterium tumefaciens. A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A. thaliana transformadas. Para analisar o comportamento deste promotor, as plantas de A. thaliana foram submetidas a estresses hídrico e salino in vitro (0h, 12h, 24h e 48h), os seus respectivos RNAs foram extraídos e a síntese de cDNA foi realizada para a quantificação da atividade transcricional do gene repórter GUS via RT-qPCR. Os nossos resultados indicaram que o promotor de CcGolS3 pode ser caracterizado como do tipo estresse-induzido, visto que o perfil transcricional do gene GUS diretamente proporcional ao tempo de duração dos estresses. O promotor do gene CcGolS3 apresenta um grande potencial para ser utilizado em projetos futuros de melhoramento genético de cafeeiros e obtenção de plantas mais tolerantes a estresses abióticos.
Caracterização in silico de genes de expansina presentes em cafeeiro (Coffea arabica L.)
(2007) Budzinski, Ilara G. F.; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
As expansinas (EXPs) são proteínas que promovem o relaxamento e extensão da parede celular em plantas, sendo codificadas por uma multifamília gênica e classificadas em: [alfa]-expansinas, [beta]-expansinas, expansin-like A (EXLA) e expansin-like B (EXLB). Estas proteínas atuam no alongamento celular, maciez dos frutos, abscisão, germinação e polinização. As [alfa]-expansinas representam a maior família e relacionam-se diretamente com o controle da extensão da parede celular em processos de desenvolvimento. Visto que a maturação uniforme dos frutos de café contribui para a qualidade da bebida, este trabalho teve por objetivo identificar e caracterizar in silico genes de expansinas envolvidas neste processo. Através da mineração dos dados do Genoma Café foram encontrados 28 contigs referentes às EXPs, sendo dois contigs de EXLB, um de EXLA e os demais pertencentes à família das [alfa]-expansinas. Dentro desta ultima família foram identificados quatro contigs relacionados com o desenvolvimento dos frutos do cafeeiro. Comparação dos contigs obtidos nos bancos do Projeto Genoma Café e de contigs no banco de dados HarvEST Coffea permitiu a caracterização in silico da expressão dos contigs nos diferentes estádios de maturação dos frutos.
Caracterização nutricional de acessos provenientes da Etiópia de café arábica
(Editora UFLA, 2015-01) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Carpentieri- Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva
Devido à necessidade cada vez maior de cultivares que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características relacionadas ao uso eficiente de nutrientes minerais é uma estratégia relevante para o melhoramento genético do café. Nesse sentido, a caracterização de acessos provenientes do centro de origem da espécie é um importante subsídio para os programas de melhoramento visando à seleção de materiais de interesse para produção de novas cultivares. Objetivou-se,no presente trabalho, caracterizar a concentração de nove nutrientes minerais em 12 acessos de Coffea arabica L., provenientes da Etiópia, em casa de vegetação, visando identificar genótipos com acumulação diferencial de nutrientes minerais em folhas, caule e raízes. Com base nos parâmetros estabelecidos, o acesso E237/CAF032 apresentou acúmulo diferencial para P, em folhas e E565/CAF009, E386/CAF131 e E332/CAF023 apresentaram concentração diferencial de N, Zn e Mn em raízes, respectivamente. O presente trabalho selecionou um acesso com potencial eficiência para uso de P e outro com potencial eficiência para o uso de N, o que pode contribuir em futuros estudos de seleção de materiais que possam ser utilizados na introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.
Composição química de cafés árabica de cultivares tradicionais e modernas
(Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa, 2013-11) Kitzberger, Cíntia Sorane Good; Scholz, Maria Brígida dos Santos; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Benassi, Marta de Toledo
O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência da diversidade genética sobre a composição química de cultivares modernas e tradicionais de café arábica brasileiro. Cultivares tradicionais (Bourbon, Catuaí e Icatu) e modernas (Iapar 59, IPR 98, IPR 99 e IPR 103) foram cultivadas nas mesmas condições edafoclimáticas e submetidas a tratamentos pós‐colheita padronizados. Determinaram-se os teores de sacarose, açúcares redutores, ácidos orgânicos (quínico, málico e cítrico), compostos fenólicos totais, ácido 5‐cafeoilquínico, compostos nitrogenados (proteína, trigonelina e cafeína), lipídeos totais, cafestol e caveol. A diversidade genética confere variabilidade à composição do café e permite a discriminação entre cultivares tradicionais e modernas. As cultivares modernas apresentam maior teor de ácidos málico e 5‐cafeoilquínico, lipídeos totais, caveol e trigonelina. Os parâmetros caveol e a relação caveol/ cafestol são propostos como discriminadores entre cultivares modernas e tradicionais, uma vez que a introgressão de genes de Coffea canephora aumenta os teores de caveol e os valores da relação caveol/cafestol.
CONCENTRAÇÃO DE NUTRIENTES MINERAIS EM ACESSOS DA ETIÓPIA DE Coffea arabica
(2011) Santos, Tiago Benedito dos; Meda, Anderson Rotter; Sitta, Renata Barrufaldi; Vespero, Eduardo Brandalize; Pavan, Marcos Antonio; Charmetant, Pierre; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva; Embrapa - Café
O sucesso do manejo nutricional em plantas depende de diversos fatores, como características químicas, biológicas e físicas do solo, além da influência do genótipo. Apesar do manejo agronômico visando à adequação do solo para a cultura do cafeeiro estar bem estabelecido, pouco se sabe sobre o efeito do genótipo na absorção e acúmulo de nutrientes minerais. Tradicionalmente, o melhoramento genético do cafeeiro foca-se em características morfológicas, resistência a doenças e na produtividade; dessa forma, a exigência nutricional foi deixada em plano secundário ao longo deste processo. Com a necessidade cada vez maior de variedades que apresentem boa produtividade com impactos menores ao meio ambiente, a introgressão de características de genótipos silvestres é uma relevante estratégia para incremento da eficiência nutricional. Neste contexto, o presente trabalho tem como objetivo caracterizar a concentração de nutrientes em 12 acessos silvestres de Coffea arabica provenientes da Etiópia, identificando genótipos de cafeeiro que apresentam acumulação diferencial de nutrientes minerais (N, P, K, Ca, Mg, Cu, Zn, B e Mn) com relação a três tecidos: folhas, caule e raiz. Entre os acessos da Etiópia, destacou-se a concentração diferencial de P em folhas do acesso CAF032, e o acúmulo em raiz de N (CAF009), Zn (CAF131) e Mn (CAF023). Bourbon teve acúmulo diferencialmente menor de P no caule e maior de Ca na raiz e Catuaí Vermelho apresentou concentração diferencial de Mg no caule. O presente trabalho é uma importante contribuição na definição de genótipos silvestres de Coffea arabica com potencial de introgressão de características relacionadas à eficiência nutricional.
Construção de uma biblioteca genômica de cromossomo artificial de bactéria de Coffea arabica
(2007) Cação, Sandra Maria Bellodi; Diniz, Leandro Eugenio Cardamone; Silva, Nathalia V.; Veniky, Filipe; Andrade, Alan Carvalho; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Embrapa - Café
A produção de mapas físicos em plantas tem grande importância para estudos de genética e melhoramento. O passo inicial para produção destes mapas é a construção de bibliotecas genômicas com largos fragmentos de DNA, em vetores do tipo cromossomo artificial de bactéria (BAC) ou de levedura (YAC). Visando a produção de um mapa físico, o objetivo deste trabalho foi construir uma biblioteca genômica de BAC de café. Fragmentos de DNA de alto peso molecular de C. arabica híbrido de Timor cv. 832/2 foram clonados no vetor pCC1BAC e transformados em E. coli DH10B. Após transformação 57000 clones foram inicialmente obtidos e ordenados manualmente em placas de 96 poços. A biblioteca foi transferida em triplicata para placas de 384 poços, com equipamento Q-BOT, resultando em 55.778 clones em 148 placas. A verificação do tamanho do inserto de 130 clones revelou tamanho médio de 115-120 Kb. A cobertura do genoma haplóide estimada para C.arabica foi de cinco vezes. A validação da biblioteca presença de DNA de cloroplasto e mitocôndria, assim como a seleção inicial com sondas para iniciar o mapeamento físico, está sendo realizada através de hibridização de colônias em membranas contendo 18.462 clones em duplicata.
Diversidade nucleotídica de genes envolvidos na biossíntese de ácidos clorogênicos de cafeeiros
(Editora UFLA, 2013-04) Ivamoto, Suzana Tiemi; Pot, David; Lannes, Sergio Dias; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio
Os ácidos clorogênicos (CGAs) são compostos químicos importantes de Coffea spp. para a qualidade da bebida, pois eles interferem na adstringência e podem alterar o aroma e sabor da bebida. Aproximadamente 310.000 ESTs de Coffea estão disponíveis e possibilitam o acesso à variabilidade nucleotídica da planta e o desenvolvimento de marcadores moleculares ligados à qualidade da bebida para as principais enzimas da via de biossíntese dos CGAs: PAL, C4H, 4CL, CQT e C3’H. Neste trabalho foram detectados polimorfismos dos tipos SNP, INDEL ou SSR dentro das sequências nucleotídidicas disponíveis no Protejo Genoma Café e no NCBI. As sequências de ESTs de CGAs foram clusterizadas pelo programa Codon Code Aligner, assim como a detecção de polimorfismos e validação dos mesmos (qualidade de cromatograma). Foram identificadas seis isoformas para PAL, uma para C4H, seis para 4CL, duas para CQT e duas para C3’H. Os contigs formados apresentaram um total de 248 polimorfismos (236 SNPs e 12 INDELs), sendo 201 na região codante (127 não sinônimos e 74 sinônimos). A frequência dos polimorfismos foi maior nas regiões UTRs (1pol/54pb), em relação à codante (1pol/81pb). A análise das sequências de C. arabica permitiu a identificação de 2 subgrupos diferentes de sequências, referentes aos seus genomas ancestrais (C. canephora e C. eugenioides). Foi observada a presença de 67,4% dos polimorfismos entre os grupos ancestrais e 32,6% dentro dos grupos em C. arabica. Esses resultados vêm permitindo definir genes tanto para estudos de expressão de homeólogos de CGAs como para o desenvolvimento de marcadores moleculares para o mapeamento genético.
Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína
(Embrapa Café, 2019-10) Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryioshi, Caroline; Girotto, Larissa; Santos, Tiago Benedito dos; Tomaz, Juarez Pires; Pereira, Luiz Filipe Protasio
O café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.
Efeito da ferrugem e da supressão de nitrogênio no nível transcricional do gene nitrato redutase (CaNR) em Coffea arabica L.
(Embrapa Café, 2013) Santos, Tiago Benedito dos; Baba, Viviane Yumi; Soares, João Danillo Moura; Carvalho, Kenia de; Braghini, Masako Toma; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas Silva
O objetivo do trabalho é avaliar se a ferrugem do cafeeiro (Hemileia vastatrix) pode modular a resposta transcricional de um gene-chave na assimilação de nitrogênio (N), a nitrato redutase, em função da restrição do nutriente e da resposta do cultivar ao patógeno. Sabe-se que o estado nutricional da planta pode influenciar a severidade do ataque por patógenos. A ferrugem no cafeeiro é um problema recorrente em todas as regiões de cultivo, afetando desde a produtividade até a qualidade final da bebida. A despeito da importância da nutrição mineral para a produtividade e seu impacto na resposta à ferrugem, existem poucos estudos relacionados ao estabelecimento da relação molecular entre o estado nutricional do cafeeiro e resposta de defesa a patógenos. Duas cultivares – uma resistente e uma suscetível à ferrugem do cafeeiro - foram submetidas a regimes diferenciais de N e inoculadas com H. vastatrix. A análise por qPCR do gene CaNR em três períodos pós-inoculação evidenciou padrões transcricionais distintos entre as duas cultivares - a cultivar suscetível apresentou um pico de expressão em período anterior a cultivar resistente. Este estudo preliminar evidencia que fatores genotípicos e nutricionais podem influenciar na atividade de genes relacionados ao metabolismo de N, dando suporte a futuras análises bioquímicas que auxiliem na compreensão de respostas fisiológicas e moleculares relacionadas com a interação da resposta de defesa e o estado nutricional.
Expressão gênica em larga escala de raizes de Coffea arabica L.
(Embrapa Café, 2015) Santos, Tiago Benedito dos; Silva, Juliana Costa; Soares, João Danillo Moura; Baba, Viviane Yumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas Silva
A utilização de novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (454-mRNAseq) é uma frente inovadora de estudos para a biotecnologia do cafeeiro, promovendo a identificação e caracterização de novos componentes genômicos de interesse. Mudas de cafeeiro foram mantidas sob supressão de fontes nitrogenadas e suas raízes foram utilizadas para construção de bibliotecas de cDNA, que foram sequenciados utilizando a plataforma GS-FLX Titanium da Roche. Foram gerados um total 809.517 reads, os quais geraram 34.654 contigs. Por meio dos transcritos gerados pelo mRNAseq de raiz espera-se identificar e caracterizar molecularmente os genes envolvidos no transporte e metabolismo de nitrogênio no cafeeiro.
Galactinol synthase transcriptional profile in two genotypes of Coffea canephora with contrasting tolerance to drought
(Sociedade Brasileira de Genética, 2015) Santos, Tiago Benedito Dos; Lima, Rogério Barbosa de; Nagashima, Getúlio Takashi; Petkowicz, Carmen Lucia de Oliveira; Carpentieri-Pípolo, Valéria; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Domingues, Douglas Silva; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves
Increased synthesis of galactinol and raffinose family oligosaccharides (RFOs) has been reported in vegetative tissues in response to a range of abiotic stresses. In this work, we evaluated the transcriptional profile of a Coffea canephora galactinol synthase gene (CcGolS1) in two clones that differed in tolerance to water deficit in order to assess the contribution of this gene to drought tolerance. The expression of CcGolS1 in leaves was differentially regulated by water deficit, depending on the intensity of stress and the genotype. In clone 109A (drought-susceptible), the abundance of CcGolS1 transcripts decreased upon exposure to drought, reaching minimum values during recovery from severe water deficit and stress. In contrast, CcGolS1 gene expression in clone 14 (drought-tolerant) was stimulated by water deficit. Changes in galactinol and RFO content did not correlate with variation in the steady-state transcript level. However, the magnitude of increase in RFO accumulation was higher in the tolerant cultivar, mainly under severe water deficit. The finding that the drought-tolerant coffee clone showed enhanced accumulation of CcGolS1 transcripts and RFOs under water deficit suggests the possibility of using this gene to improve drought tolerance in this important crop.
IDENTIFICAÇÃO DE CLONES BAC COM MARCADORES MOLECULARES VISANDO A INTEGRAÇÃO DE MAPAS FÍSICOS E GENÉTICOS
(2011) Cação, Sandra Maria Bellodi; Silva, Nathalia Volpi e; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Embrapa - Café
Bibliotecas BAC (Cromossomo Artificial de Bactéria) têm sido muito utilizadas para suporte de trabalhos de mapeamento físico, clonagem posicional, mapeamento comparativo e estudos de evolução de genomas. Visando realizar o mapeamento físico em Coffea arabica, iniciamos a identificação e caracterização de clones BAC de uma biblioteca de C. arabica hibrido timor 832/2. A biblioteca contém 56.832 clones BACs com tamanho médio de 120 Kb, representando uma cobertura de 5,5 vezes o tamanho do genoma do C. arabica. Os clones da biblioteca BAC foram inicialmente agrupados em pools de placa com 384 clones, e superpools contendo 15 pools de placa o que representa 5.760 clones. A identificação do BAC de interesse foi realizada através da seleção por PCR nos superpools e pools, seguida por hibridização em filtros de colônia contendo 384 clones. Para a seleção dos superpools e pools de placas foram utilizados os primers baseados em AFLPs relacionados com lócus de resistência à ferrugem (M-8, SAT-244 e BA-124). Também foram utilizados os marcadores SSR-18 (GL1), SSR-16 (GL2), ACGG-1 (GL3), CCG-3 (GL6), de quatro grupos de ligação do mapa genético parcial de C. arabica (Oliveira et al, 2007) visando identificar e posicionar BAC para cada grupo de ligação. Os BAC selecionados nas hibridizações foram confirmados através de extração individual do clones, seguida por PCR para checar a marca de interesse. Até o momento foram identificados 32 clones BAC para as marcas de resistência a ferrugem e 98 para os 4 grupos de ligação. Os BAC selecionados serão sequenciados para o mapeamento físico da região contendo lócus de resistência à ferrugem.
Identificação de novos acessos de Coffea arabica introduzidos na coleção da Etiópia do IAPAR
(Embrapa Café, 2015) Ferreira, Rafaelle Vecchia; Andrade, Giselly Aparecida; Charmetant, Pierre; Leroy, Thierry; Domingues, Douglas Silva; Pereira, Luiz Filipe Protasio
Marcadores microssatélites foram utilizados na discriminação de novos acessos de Coffea arabica que foram introduzidos na coleção da Etiópia do IAPAR, provenientes de uma coleção similar na República de Camarões. Inicialmente 46 acessos de Camarões foram repassados para a Embrapa CPAC (Embrapa Cerrados – Planaltina-DF), onde ficaram em quarentena. Em seguida, estes acessos foram transferidos para o IAPAR, porém durante os processos de quarentena e transferência, alguns dos acessos foram misturados. Visando identificar corretamente os acessos e também validar os SSRs previamente identificados, todos os 46 acessos foram analisados em géis de poliacrilamida. Os 8 locos microssatélites utilizados geraram um total de 19 alelos, com uma média de 2,3 alelos por loco. A variação alélica foi de 2 a 3 alelos por loco. Para realizar as análises de divergência genética uma matriz de distância foi computada e utilizada para obter uma árvore (dendograma) de diversidade global. Observou-se 3 diferentes agrupamentos entre os acessos ET34, Java e ET19. A análise genotípica dos diferentes locos microssatélites indicou quais acessos corresponderiam corretamente a ET34, Java ou ET19, já que este último teve o papel de controle positivo. Os marcadores microssatélites foram eficientes para discriminar os acessos de C. arabica provenientes de Camarões e o número de locos utilizado (8) também foi suficiente para a separação entre os acessos com seus respectivos genótipos.