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Colonização de Coffea arabica L. por bactérias endofíticas promotoras de crescimento
(Universidade Federal de Viçosa, 2001) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Silva, Daison Olzany; Universidade Federal de Viçosa
Os protocolos de esterilização superficial e de isolamento de bactérias endofíticas foram estabelecidos para frutos e caules de café arábica. Um isolado bacteriano produtor de pectina liase extracelular foi fisiologicamente e fenotipicamente caracterizado. A incidência de microbiota epifítica e endofítica foi constatada em amostras de frutos de café arábica oriundas de diferentes localidades. Bactérias, leveduras e fungos filamentosos foram isolados, sendo em Viçosa 1.042 isolados epifíticos e 282 potencialmente endofíticos, em Serra do Salitre 71 isolados epifíticos e 28 potencialmente endofíticos e em Patrocínio 85 isolados epifíticos e 33 potencialmente endofíticos. As bactérias foram isoladas em maior número, sendo que os bastonetes predominaram sobre os cocos e, dentre os bastonetes, as bactérias Gram negativas. A colonização de explantes de Coffea arabica L. por bactérias endofíticas foi demonstrada in situ pela técnica de imunofluorescência e comprovada pela recuperação das bactérias após sua reintrodução. Cinco isolados de bactérias endofíticas promoveram o crescimento de explantes de Coffea arabica e Coffea canephora, indicando que a sua interação não é espécie-específica.
Colonização epifítica e endofítica de frutos de Coffea arabica L. por bactérias metilotróficas facultativas de pigmentação rósea
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Mezêncio, José Mário da Silveira; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias metilotróficas facultativas de pigmentação rósea (PPFMs - Pink-Pigmented Facultative Methylotrophs) do gênero Methylobacterium têm sido encontradas colonizando epifiticamente a maioria das espécies vegetais. As PPFMs participam do metabolismo de nitrogênio, induzem a germinação de sementes, utilizam o metanol catabolizado pelas plantas, produzem citocininas e podem proteger as plantas contra fatores adversos de ambiente. As PPFMs são facilmente reconhecidas pela coloração rósea de suas colônias em ágar nutriente, pelo seu crescimento em meio de cultivo com um composto orgânico C-1 como única fonte de carbono e pela formação de película ou anel superficial em cultura líquida estática. Embora bactérias PPFMs tenham sido isoladas de mais de 100 espécies de plantas, não há relatos anteriores de sua colonização em frutos de café. O objetivo do presente trabalho foi verificar a colonização epifítica e endofítica por bactérias PPMFs, antes da colheita, de frutos sadios de café arábica em diferentes estádios de desenvolvimento, amostrados em Viçosa, em Serra do Salitre e em Patrocínio, Minas Gerais. Cada amostra de frutos foi preparada seguindo-se as etapas de pesagem, lavagem em água de torneira corrente, lavagem individual dos frutos com detergente e desinfetante SANPIC e enxágüe com água de torneira corrente. A seguir, em condições assépticas, os frutos foram agitados em água esterilizada. Uma série de diluições em tampão fosfato a partir da água onde os frutos foram agitados foi plaqueada em meio sólido R2A, para o isolamento da microbiota epifítica. Os frutos pré-lavados, após esterilização superficial, foram triturados sob condições assépticas. O material triturado foi utilizado para o isolamento da microbiota endofítica em meio R2A. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi transferida para nova placa de meio R2A para obtenção de culturas puras. As características morfológicas dos isolados foram determinadas pela coloração de Gram. Os isolados bacterianos bastonetes coloração Gram negativo, tanto epifíticos com endofíticos, que apresentaram colônias com pigmentação rósea em meio R2A, foram cultivadas a 28°C em meio sólido glicerol-peptona (GP), em ágar nutriente e em cultura estática de caldo nutriente. Após duas semanas de cultivo, as culturas foram analisadas quanto à pigmentação em ágar nutriente, quanto à utilização de glicerol como fonte de carbono em meio GP e quanto à formação de anel róseo na superfície do caldo nutriente. Observou-se que isolados bacterianos epifíticos e endofíticos com características culturais de PPFMs do gênero Methylobacterium estavam presentes em todas as populações obtidas a partir de frutos de café coletados em Viçosa e nas duas localidades do Cerrado mineiro. As bactérias PPFMs isoladas a partir das populações obtidas em Viçosa representaram 13 e 16% do total de bastonetes Gram negativos epifíticos e endofíticos, respectivamente. Enquanto que nas populações do Cerrado, estas bactérias representaram, respectivamente, 61 e 50% dos isolados epifíticos e endofíticos. Concluiu-se, portanto que as bactérias PPFMs colonizam epifítica e endofiticamente os frutos de café arábica.
Comparação da microbiota da superfície de frutos de café (Coffea arabica L.) colhidos em duas localidades
(2000) Paula, Evandro Marcus de; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Pitta, Otávio P. L.; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A expressão final da qualidade da bebida do café é o resultado de um conjunto complexo de interação de fatores bióticos e abióticos, entre os quais se destaca a microbiota presente nos frutos durante os vários estádios de maturação. Este trabalho objetivou quantificar e caracterizar quanto à morfologia as populações microbianas encontradas na superfície dos frutos durante quatro estádios de desenvolvimento. As amostras de frutos de café arábica ‘Catuai Vermelho’ nos estádios verde, verde-cana, cereja e passa foram coletadas em Viçosa, MG, e Serra do Salitre, MG. Os grãos foram desinfestação individualmente para se determinar o número de células viáveis pela técnica de contagem de colônias em placas de Petri. A seguir foi feito o isolamento de microrganismos, a partir de colônias morfologicamente distintas, em cada uma das placas. Foram isolados 141 culturas a partir dos grãos amostrados em Viçosa, 85% delas sendo de bactérias, 10% de leveduras e 4% de fungos filamentosos. Diferentemente, de um total de 268 culturas provenientes dos isolados de Serra do Salitre, 94% foram bactérias, 2,5% leveduras e 3,5% fungos filamentosos. Nesta localidade, a diversidade de tipos morfológicos foi maior. Foi constatada a ocorrência da sucessão microbiana, a qual é evidente nos estádios cereja e passa. As culturas de bactérias, fungos filamentosos e leveduras provenientes das duas localidades foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para futuros estudos de biotecnológicos.
Comprovação do caráter endofítico de bactérias isoladas de frutos e caules de Coffea arabica L.
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Mezêncio, José Mário da Silveira; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias endofíticas que colonizam os tecidos vegetais internos e não causam danos à planta têm despertado grandes interesses por suas possíveis aplicações na agricultura e biotecnologia. Na prática, as bactérias são consideradas endofíticas quando isoladas ou extraídas de material vegetal, cuja superfície foi esterilizada. No entanto, o isolamento de bactérias a partir de tecidos superficialmente esterilizados demonstra, de forma apenas indireta, a colonização endofítica, fazendo-se necessária a demonstração da interação bactéria endofítica-planta in loco por meio de estudos microscópicos associados a técnicas imunológicas ou a técnicas moleculares. O caráter endofítico também pode ser confirmado pela recuperação da bactéria potencialmente endofítica após sua reintrodução na planta. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar o caráter endofítico de quatro isolados bacterianos obtidos de caules (CL8) e frutos cereja (F7-4, F6 e SS110) superficialmente esterilizados de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho, oriundos de Viçosa, Araponga, Serra do Salitre, MG e Londrina, PR. Cada isolado (suspensão em caldo nutriente contendo 10 7 a 10 8 UFC/mL) foi inoculado em explantes de ápice caulinar de Catuaí Vermelho, obtidos por embriogênese somática a partir de explantes foliares e cedidos pelo Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro/Bioagro/UFV. Como controles, foram utilizados explantes inoculados com caldo nutriente estéril. Após 12 dias na câmara de crescimento, a 25±2°C e fotoperíodo de 12h, os explantes foram esterilizados superficialmente e, em seguida, as folhas e os caules foram cortados em pedaços pequenos, em condições assépticas, e inoculados separadamente em tubos contendo caldo nutriente. As culturas obtidas em caldo nutriente foram repicadas para novo meio nutriente para avaliação de suas características e pureza. A colonização endofítica de C. arabica pelos isolados CL8, F7-4, F6 e SS110 foi observada pelo crescimento bacteriano em todos os tubos de caldo nutriente, com exceção dos tubos inoculados com folhas cortadas do explante inoculado com o isolado CL8. Este fato indica que o isolado CL8, que foi obtido de caule, apenas colonizou endofiticamente os caules dos explantes, no período avaliado. As culturas recuperadas apresentaram as características típicas de cada isolado e estavam puras. Não houve crescimento bacteriano a partir das folhas e dos caules cortados dos explantes controles. A colonização endofítica pelo isolado CL8 foi demonstrada in situ pela técnica de imunofluorescência indireta, utilizando-se antissoro específico produzido no Laboratório de Imunologia e Virologia Molecular/UFV. O isolado CL8 foi detectado no sistema vascular do caule de explantes de Catuaí Vermelho. O caráter endofítico dos isolados CL8, F7-4, F6 e SS110 foi, portanto, comprovado.
Evidências da latência e associação endofítica de Colletotrichum sp. em tecidos de Coffea arabica L.
(2003) Paresqui, Leonardo; Zambolim, Laércio; Costa, Helcio; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Batista, Ulisses Gomes; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Estudos têm relatado a freqüente interação de espécies de Colletotrichum spp. com diferentes hospedeiros, apresentando-se em estágio de latência ou ainda em associação endofítica. A comprovação da patogenicidade de Colletotrichum sp. em cafeeiro ainda é objeto de estudo, visto que os sintomas associados ao fungo são constantemente atribuídos a causas fisiológicas, desnutrição do cafeeiro em ramos de alta carga e condições climáticas. Entretanto, os relatos de ataques do fungo parecem ser constantes em condições de campo. Há uma falta de informações sobre em quais condições Colletotrichum sp. pode se manifestar e causar prejuízos, além da falta de conhecimento sobre os sintomas que podem estar associados ao patógeno, que muitas vezes levam a diagnósticos errados. O objetivo deste trabalho foi estabelecer uma metodologia eficiente para a sanitização de material vindo de campo, visando testes de patogenicidade deste fungo ao cafeeiro. Foram coletados no campo, ramos em desenvolvimento e frutos de plantas de Catuaí Vermelho. A esterilização superficial dos ramos foi feita de acordo com o método descrito por SAKIYAMA et al. (2001), com algumas modificações. Visando a detecção de infecção latente de Colletotrichum sp. em cafeeiro, foram coletados no campo ramos em desenvolvimento e frutos de plantas Catuaí Vermelho. As amostras foram esterilizadas superficialmente e submersas em concentrações crescentes de Paraquat (1-1’- dimetil 4-4’ - bipiridilio dicloreto) por 1 minuto e então incubadas. Como controle foram utilizados ramos e frutos coletados no campo e incubados sem nenhum tratamento. Pode-se observar que, mesmo superficialmente esterilizados, os tecidos apresentavam abundante esporulação de Colletotrichum sp. após seis dias de incubação em condições assépticas. Todos os tratamentos submetidos a concentrações crescentes de Paraquat também apresentaram sintomas e abundante esporulação de Colletotrichum sp. seis dias após a incubação. O controle permaneceu sadio até 15 dias após incubação. Há evidências de que este fungo é um oportunista que se manifesta externamente nos tecidos quando este sofre algum tipo de estresse. Neste trabalho foram obtidos indícios de que Colletotrichum sp., provavelmente C. gloeosporioides, apresenta relação endofítica nos tecidos de Coffea arabica.
Microbiota endofítica em frutos de Coffea arabica L.
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Paula, Evandro Marcus de; Pereira, Pollyana C.; Pitta, Otávio P. L.; Hara, André; Borges, Arnaldo Chaer; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Os microrganismos estão intimamente associados a plantas, podendo colonizar os tecidos vegetais internos (microbiota endofítica) e a superfície de órgãos (microbiota epifítica). No preparo via seca do café, a fermentação ocorre na massa de frutos colhidos em diferentes estádios de desenvolvimento. Embora existam vários estudos mostrando que bactérias e leveduras participam desse processo fermentativo, a microbiota endofítica, presente nos frutos de café antes da colheita, tem sido pouco caracterizada. Os objetivos do presente trabalho foram quantificar e caracterizar morfologicamente a microbiota endofítica que coloniza frutos sadios de café arábica em diferentes estádios de desenvolvimento, antes da colheita. Os frutos foram amostrados em Viçosa em intervalos de 15 dias, nos seguintes estádios de desenvolvimento: chumbinho-pequeno, chumbinho-médio, verde, verde-cana, cereja e passa. Em Serra do Salitre e em Patrocínio foi realizada apenas uma amostragem de cada localidade, dos estádios verde, verde-cana, cereja e passa. Em cada estádio foram coletados 24 frutos sadios de 12 plantas (dois frutos sadios de cada planta). Em Viçosa, o procedimento foi repetido utilizando-se outras 12 plantas da mesma lavoura. Os frutos, após esterilização superficial com etanol 70% e hipoclorito de sódio a 5%, foram triturados sob condições assépticas. O material triturado foi utilizado para quantificação e isolamento da microbiota endofítica. A determinação do número de células viáveis foi realizada pela contagem de colônias em placas, em meio R2A. Os microrganismos endofíticos foram isolados a partir das placas de cada amostragem. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi transferida para nova placa de meio R2A, para obtenção de culturas puras. As características morfológicas dos isolados foram determinadas pela coloração de Gram. As populações potencialmente endofíticas encontradas nos diferentes estádios de desenvolvimento dos frutos variaram de 10 2 a 10 4 UFC/g de peso fresco do fruto, nas três localidades. Foram obtidas populações endofíticas a partir de frutos no estádio passa somente em Serra do Salitre. Em um total de 282 isolados obtidos em Viçosa, as bactérias representaram aproximadamente 84%, as leveduras 7% e os fungos filamentosos 9%. Em Serra do Salitre foram obtidos apenas isolados bacterianos (bastonetes Gram positivos e Gram negativos). Em Patrocínio, foram obtidas bactérias e leveduras, mas não fungos filamentosos. Entre os isolados bacterianos endofíticos das três localidades, os bastonetes predominaram sobre os cocos. Dentre os bastonetes, as bactérias Gram negativas foram isoladas em maior número. Todas as culturas potencialmente endofíticas foram incorporadas ao banco de germoplasma do Departamento de Microbiologia da UFV, para posterior identificação e futuros estudos biotecnológicos.
Promoção de crescimento de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre ex Froenher por bactérias endofíticas
(2003) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Pitta, Otávio P. L.; Pereira, Pollyana C.; Medina, Pilar X. L.; Campos, Maria Rita de Cássia; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
As bactérias endofíticas colonizam os tecidos vegetais internos e não causam danos visíveis à planta. Entre outros efeitos benéficos, as bactérias endofíticas podem promover o crescimento da planta hospedeira em função da produção de reguladores de crescimento, do aumento da absorção de minerais por sideróforos ou da fixação de nitrogênio. O objetivo do presente trabalho foi demonstrar a promoção de crescimento em explantes da cultivar Catuaí Vermelho IAC-15 de Coffea arabica L. e em explantes da cultivar Apoatã de Coffea canephora Pierre ex Froenher por cinco isolados bacterianos (CL4, CL8, F7-4, F6 e SS110). Os isolados potencialmente endofíticos foram obtidos de caule e frutos cereja superficialmente esterilizados de Coffea arabica L. cv. Catuaí Vermelho, oriundos de Viçosa, Araponga, Serra do Salitre, MG e Londrina, PR. Os explantes, obtidos por embriogênese somática, a partir de explantes foliares, foram cedidos pelo Laboratório de Biotecnologia do Cafeeiro/Bioagro/UFV em duas categorias: explantes com segmento nodal contendo uma ou duas gemas (0,5 a 1,0 cm de altura) e explantes de ápice caulinar contendo três a quatro gemas axilares (1,0 a 2,0 cm de altura). Cada um dos cinco isolados bacterianos (suspensão em caldo nutriente contendo 10 7 a 10 8 UFC/mL) foi inoculado em um explante das duas categorias de Catuaí Vermelho e de Apoatã. Como controles, foram utilizados explantes não inoculados, explantes inoculados com caldo nutriente esterilizado ou explantes inoculados com suspensão bacteriana autoclavada. O total de 30 tratamentos foi disposto na câmara de crescimento em delineamento em blocos casualizados com quatro repetições a 25±2°C e fotoperíodo de 12h. Aos 24 e 52 dias após a inoculação, verificou-se que os isolados CL4, CL8, F7-4, F6 e SS110 promoveram o crescimento dos explantes de Catuaí Vermelho e de Apoatã, pois estes apresentaram desenvolvimento maior do que o dos respectivos controles. O fato de esses isolados obtidos de Catuaí Vermelho (C. arabica) terem colonizado explantes de Apoatã (C. canephora), indica que essa colonização não é espécie-específica. Além de promover o crescimento apical, os isolados promoveram a diferenciação de primórdios radiculares em alguns explantes. A rizogênese ocorreu também em um explante controle, no entanto, o desenvolvimento desse explante e o tamanho da raiz foram menores. Observou-se também que houve maior incidência de morte foliar entre os explantes controle do que entre os explantes colonizados pelas bactérias endofíticas. Estas bactérias apresentaram, portanto, potencial de uso como promotoras de crescimento na cultura de tecidos de café.
Quantificação e caracterização da microbiota da superfície de frutos de café (Coffea arabica L.) em Viçosa, MG durante a safra de 2000
(2000) Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Paula, Evandro Marcus de; Pereira, Pollyana C.; Hara, André; Silva, Daison Olzany; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Amostras de frutos de café arábica cultivar Catuaí Vermelho IAC-99, em diferentes estádios de desenvolvimento, foram coletadas com o objetivo de quantificar e caracterizar morfologicamente a microbiota da superfície. Após o processamento das amostras, determinou-se o número de células viáveis pela contagem de colônias em placas. Uma colônia representativa de cada tipo morfológico foi isolada e estocada. Um banco de culturas foi obtido, com um total de 1042 isolados, sendo 894 bactérias, 86 leveduras e 62 fungos filamentosos. Verificou-se uma sucessão de populações microbianas nos estádios de cereja e passa, com decréscimo da população de bactérias e aumento de fungos filamentosos e, especialmente, leveduras.
Reproducibility of the RAPD marker and its efficiency in coffee tree genotype grouping analysis
(Crop Breeding and Applied Biotechnology, 2002) Sakiyama, Ney Sussumu; Teixeira-Cabral, Terezinha Aparecida; Zambolim, Laércio; Pereira, Antonio Alves; Barros, Everaldo Gonçalves; Sakiyama, Cássia Camargo Harger
The genetic diversity of Coffea arabic L. cultivars is relatively narrow and its assessment and increase is important for breeding. Fifty two arbitrary primers were used to evaluate the reproducibility and the influence of the number of RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) markers on the estimation of genetic distances among 40 genotypes of Coffea spp. The average number of polymorphic bands was 6.69 per primer among all genotypes, and 1.27 among arabica coffee genotypes. RAPD markers were efficient in estimating the genetic distances among the genotypes. The increase in RAPD loci number during grouping analysis did not affect the major groups’ composition; however, it affected the composition of subgroups. Marker reproducibility was 76.88% and replicated data was recommended for distinguishing genotypes with the same genetic background.
Uso de marcadores RAPD na avaliação da diversidade genética entre acessos de Coffea
(2000) Cabral, Terezinha Aparecida Teixeira; Sakiyama, Ney Sussumu; Zambolim, Laércio; Pereira, Antônio Alves; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A ampliação da diversidade genética é importante para o melhoramento genético do café, fazendo com que informações sobre distâncias genéticas entre acessos de um banco de germoplasma baseadas em marcadores moleculares sejam úteis na identificação desta diversidade. Marcadores RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) foram usados para avaliar as distâncias genéticas entre 40 genótipos de café do banco de germoplasma da Universidade Federal de Viçosa (incluindo quatro espécies diferentes). Foram utilizados 11 primers arbitrários da Operon Technologies, Inc., com repetição. Os produtos amplificados foram separados em geis de agarose 1,4%, tratados com brometo de etídeo e visualizados em um transiluminador UV. A técnica RAPD foi eficiente na identificação de variações entre acessos de Coffea. O agrupamento baseado no estudo com estes marcadores concordou com as relações genéticas previamente conhecidas.
Uso de marcadores RAPD no estudo de variabilidade em clones de Coffea canephora var. Conillon
(2000) Silva, Dalza Gomes da; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Sakiyama, Cássia Camargo Harger; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Pereira, Antônio Alves; Cabral, Terezinha Aparecida Teixeira; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Avaliou-se quatro repetições de 12 clones que apresentaram variabilidade de reação à H. vastatrix. Oito indivíduos dos clones 03 e 07 foram analisados quando inoculados com as raças I, II, III e XIII. Selecionou-se também, cinco clones que apresentaram reação uniforme quando inoculados com quatro raças do patógeno, totalizando 76 indivíduos. Pelo método de agrupamento de Tocher, os 76 indivíduos formaram 16 grupos. As quatro repetições de cada clone formaram grupos distintos, entretanto, o indivíduo 21, correspondente à repetição I do clone 104-A, formou isoladamente o grupo 16, mostrando-se divergente dos demais. Os clones 104-A e 104-B formaram um grupo, e os clones 110-A e 110-B, outro grupo, indicando que são muito próximos geneticamente. Os primers utilizados não foram capazes de detectar diferenças entre os clones quando se considera o ciclo de maturação, da mesma forma que não foi possível observar diferenças intraclones. Por meio de marcadores RAPD, não foi possível detectar diferenças intraclones da variedade Conillon que apresentaram instabilidade de reações a H. vastatrix. Da mesma forma, não foi possível diferenciar clones de diferentes ciclos de maturação. A técnica de RAPD foi eficaz no estudo de variabilidade genética em C. canephora.