Navegando por Autor "Santos, Daiene B. M."

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    Identificação de ESTS tecido-específicas no banco de dados do genoma funcional de Coffea spp.
    (2007) Santos, Daiene B. M.; Almeida, Juliana Dantas de; Barros, Leila M. G.; Carneiro, Mauro; Silva, Felipe R. da; Embrapa - Café
    O projeto Brasileiro Genoma Café foi elaborado e executado com o objetivo de fornecer informações sobre o genoma do cafeeiro aos pesquisadores que desenvolvem variedades melhoradas, em busca da produtividade e qualidade de grãos. Nesse projeto foram seqüenciados 218.150 clones distintos de ESTs (Expressed Sequenced Tags) escolhidos aleatoriamente em 49 bibliotecas de cDNA de C. arabica, C. canephora e C. racemosa, as quais representam diferentes tecidos em estágios específicos de desenvolvimento e tecidos submetidos a estresses biótico e abiótico. Após a remoção de contaminações e seqüências de baixa qualidade, as 154.770 ESTs restantes foram agrupadas em 45.366 clusters (UniGenes), dos quais cerca de 27% não apresentam similaridade significativa com seqüências protéicas já descritas. A fim de selecionar genes preferencialmente expressos na raiz, no fruto, na folha e no botão floral, realizamos uma análise in silico, visando a prospecção dos seus respectivos promotores em um próximo passo. Para tal, foram feitas comparações por meio do Teste Exato de Fisher, entre grupos formados por bibliotecas de ESTs obtidas a partir de um único tipo de tecido e grupos formados pelas bibliotecas restantes, tendo-se como resultado a seleção de UniGenes que possuem grande chance de serem tecido-específicos. Dessa forma, foram selecionados 103 UniGenes que apresentam níveis significativamente distintos de transcritos oriundos de cada um dos tecidos, sendo 18 de folhas, 40 de frutos, 14 de raiz e 31 de botões florais. Dentre os Unigenes selecionados, foram escolhidos três de cada um dos tecidos e um constitutivo para as validações experimentais. O critério de escolha desses Unigenes se baseou no grau de ineditismo, na especificidade dos unigenes e no nível de expressão. Para confirmar o caráter de tecido especificidade dos genes escolhidos, serão realizadas análises de Real Time RT-PCR e Northern blot.
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    Prospecção de promotores tecido-específicos em café
    (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2008-12) Almeida, Juliana D.; Barros, Leila M.G.; Santos, Daiene B. M.; Cotta, Michelle G.; Barbosa, Eder. A.; Cação, Sandra B.; Eira, Miriam T. S.; Alves, Gabriel S.C.; Vinecky, Felipe; Pereira, L.F.P.; Silva, Felipe R.; Andrade, A. C.; Marraccini, Pierre; Carneiro, M.
    A maioria dos organismos transgênicos relatados na literatura foi obtida utilizando promotores constitutivos. No entanto, existem restrições econômicas, ambientais e de biossegurança relacionadas à expressão indiscriminada (constitutiva) de genes heterólogos. O uso de promotores tecido-específicos e induzidos podem suavizar esses problemas por limitar a expressão do transgene aos tecidos e às condições necessárias. Os promotores atualmente utilizados pela EMBRAPA são de propriedade transnacional, onerando as pesquisas e causando dependência tecnológica. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de encontrar e caracterizar promotores específicos de tecidos e órgãos em Coffea spp. Nós utilizamos o banco de dados genoma Café como ferramenta in silico para identificar genes expressos preferencialmente em raiz, folha e fruto. Dessa forma, achamos 72 candidatos órgão-específicos: 18 expressos em folhas, 14 em raiz e 40 em frutos. Alguns desses candidatos foram testados in vitro utilizando-se ensaios RT- PCR, PCR semi-quantitativa, northern blotting e qPCR. Todos os quatro candidatos folha-específicos testados (GCFo1, GCFo2, GCFo3 e GCFo4) e pelo menos um dos dois candidatos fruto- específicos testados (GCFr1 e GCFr2) tiveram o seu caráter órgão-específico confirmado. Ensaios de expressão temporal e espacial mostraram que GCFr2 tem um pico de expressão no endosperma, 180 dias depois do florescimento. Os genes mais expressos de folha (GCFo3 e GCFo4) e de fruto (GCFr2) foram usados como sondas para isolar seus respectivos promotores através do screening de bibliotecas de BAC ou utilizando a técnica de 5 ́RACE.