Prospecção de promotores tecido-específicos em café

Abstract

A maioria dos organismos transgênicos relatados na literatura foi obtida utilizando promotores constitutivos. No entanto, existem restrições econômicas, ambientais e de biossegurança relacionadas à expressão indiscriminada (constitutiva) de genes heterólogos. O uso de promotores tecido-específicos e induzidos podem suavizar esses problemas por limitar a expressão do transgene aos tecidos e às condições necessárias. Os promotores atualmente utilizados pela EMBRAPA são de propriedade transnacional, onerando as pesquisas e causando dependência tecnológica. Portanto, o objetivo deste trabalho foi o de encontrar e caracterizar promotores específicos de tecidos e órgãos em Coffea spp. Nós utilizamos o banco de dados genoma Café como ferramenta in silico para identificar genes expressos preferencialmente em raiz, folha e fruto. Dessa forma, achamos 72 candidatos órgão-específicos: 18 expressos em folhas, 14 em raiz e 40 em frutos. Alguns desses candidatos foram testados in vitro utilizando-se ensaios RT- PCR, PCR semi-quantitativa, northern blotting e qPCR. Todos os quatro candidatos folha-específicos testados (GCFo1, GCFo2, GCFo3 e GCFo4) e pelo menos um dos dois candidatos fruto- específicos testados (GCFr1 e GCFr2) tiveram o seu caráter órgão-específico confirmado. Ensaios de expressão temporal e espacial mostraram que GCFr2 tem um pico de expressão no endosperma, 180 dias depois do florescimento. Os genes mais expressos de folha (GCFo3 e GCFo4) e de fruto (GCFr2) foram usados como sondas para isolar seus respectivos promotores através do screening de bibliotecas de BAC ou utilizando a técnica de 5 ́RACE.