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Análise da expressão de genes candidatos para a tolerância à seca em folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, caracterizados fisiologiamente
(2007) Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Vânia Aparecida; Elbelt, Sonia; Guimarães, Breno Lourenzzo Salgado; Loureiro, Marcelo Ehlers; DaMatta, Fábio Murilo; Ferrão, Maria Amélia Gava; Fonseca, Aymbiré Francisco Almeida da; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Genes candidatos envolvidos na tolerância à seca no cafeeiro, foram selecionados através de uma analise in silico (Northern eletrônico) das bibliotecas de cDNA SH2 e SH3 presentes na Base de Dados do Genoma Café. Assim, 18 "contigs" apresentando, uma expressão diferencial nas análises in silico, foram identificados e caracterizados por análises de Northern-blot, utilizando-se RNA total extraído de folhas de clones de Coffea canephora var. Conillon, sensíveis e tolerantes à seca, caracterizados fisiologicamente em experimentos com vasos realizados em casa de vegetação. Os resultados de caracterização fisiológica indicam que o clone 22 (sensível) apresentou queda mais rápida do potencial hídrico, devido à maior condutância estomática. Além disso, sob -3,0MPa, o clone 22 apresenta menor fotossíntese que os demais, devido ao maior estresse oxidativo que ocorre nas folhas. Os resultados das análises da expressão gênica indicam que a maioria dos genes candidatos identificados pelas análises de Northern eletrônico, também apresentavam expressão diferencial nas análises por Northern-blot. Além disso, alguns desses genes candidatos, apresentavam perfil de expressão diferencial entre os quatro materiais genéticos testados (clones sensíveis vs. tolerantes à seca). Perspectivas de uso dessas informações são discutidas. Palavras-chave: tolerância seca, estresse
Análise in silico de genes potencialmente envolvidos na resposta aos estresses abióticos, presentes na base de dados do genoma café
(2005) Vinecky, Felipe; Brito, Kelly Martins de; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Os danos potenciais dos estresses abióticos tais como seca, salinidade e temperaturas extremas na produção agrícola mundial é alarmante, tendo em vista as constantes alterações climáticas observadas nas últimas décadas ao redor do globo. Desta forma, a ampliação do conhecimento científico acerca dos fatores genéticos envolvidos na tolerância dos vegetais a esses estresses, com vistas ao melhoramento genético destas características, é prioritário. Foi concluído recentemente, com o apoio do Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café (CBP&D-Café), o projeto Genoma Café. Este projeto consistiu no seqüenciamento em larga escala de genes expressos (ESTs) de café e teve como meta, identificar e anotar de 20 a 30.000 genes de Coffea spp. a partir do seqüenciamento de 200.000 clones de ESTs obtidos de diversas bibliotecas de cDNA, inclusive aquelas oriundas de material vegetal submetido a estresses abióticos. Com a conclusão do projeto, está disponível para pesquisa um banco de dados contendo uma parcela significativa dos genes expressos em café (transcriptoma), associados às diversas condições de estresse submetidas ou tecidos utilizados para a construção das bibliotecas. O objetivo do presente trabalho, foi realizar uma análise prospectiva dos fatores genéticos potencialmente associados à resposta aos estresses abióticos, presentes na Base de Dados do Genoma Café. Essa análise baseou-se na identificação de genes de café com alta similaridade aos previamente descritos, caracterizados como genes envolvidos na resposta aos estresses abióticos (EREA), em outras espécies vegetais. Através das análises de tBlastn, genes de café com alto nível de similaridade (e-value [=ou<] 10-20) aos 355 genes EREA pesquisados, foram identificados, em mais de 91% dos casos. Apenas 5% dos genes EREA pesquisados, não resultaram em genes análogos de café, com nível significativo de similaridade (e-value [=ou<] 10-5). A observação de que a maioria desses genes não encontrados na base de dados do café, são genes relacionados às respostas ao frio, pode ser justificada pela ausência de ESTs provenientes de bibliotecas de cDNA, com esse tipo de estresse. Por outro lado, essas diferenças poderiam estar relacionadas às diferenças fisiológicas marcantes entre arabidopsis e cafeeiro, com relação à tolerância ao frio, uma vez que grande parte dos genes EREA utilizados nesta pesquisa, são provenientes de arabidopsis. Pode-se concluir com os resultados obtidos, que a utilização da Base de Dados do Genoma Café é uma ferramenta poderosa na rápida identificação e seleção de potenciais genes de interesse agronômico de café, para a realização de ensaios experimentais de caracterização funcional.
Análise in silico dos ESTs isolados de Coffea arabica infestada com Meloidogyne paranaensis
(2007) Albuquerque, Erika V.S.; Silva, Marilia S.; Teixeira, Cristiane de Camargo; Campos, Magnolia de Araujo; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Embrapa - Café
O ataque dos nematóides constitui grande problema fitossanitário para a cultura do café pelos grandes prejuízos que causam e pela dificuldade de controle. Entretanto, é difícil o melhoramento de C. arabica para a introgressão de fontes de resistência caracterizadas em C. canephora. A base do conhecimento da genética funcional do cafeeiro recebeu grande aporte de informações pela implementação do Projeto Genoma Café Brasileiro (CafEST), cujo banco de dados reuniu seqüências expressas em diferentes tecidos e tratamentos em C. arabica, C. canephora e C. racemosa . Foram gerados mais de 30 mil unigenes, a partir de 154770 reads presentes nas bibliotecas do CafEST. Entretanto, apenas 6483 reads são oriundos de raiz, sendo que a maior parte destes (76%) provém de uma biblioteca de estresse abiótico. Apenas 302 reads, que na sua maioria são singlets, correspondem à biblioteca desafiada com nematóide (NS1), em uma condição de interação compatível com cafeeiro suscetível. Neste trabalho foram feitas análises da biblioteca NS1 no contexto do CafEST com o auxílio das ferramentas desenvolvidas no Laboratório de Bioinformática da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. A busca por seqüências específicas de NS1 gerou uma lista de 60 clusters (2 contigs e 58 singlets), que foram categorizados de acordo a similaridade com o banco de dados não redundante do National Center for Biotechnology Information (NCBI). Os resultados de BlastX indicaram que metade dos clusters não está presente no banco (no hits), 40% tem origem vegetal e 10% são de microrganismos ou animais. A comparação da biblioteca NS1 com o restante das bibliotecas do CafEST, assim como com duas outras bibliotecas de raiz induzidas por estresse abiótico (bion e alumínio) demonstrou não haver expressão significativamente diferente pelo teste de Fisher. Como a biblioteca NS1 possui alto índice de novidade (94.7%) e pequeno agrupamento dos reads, pudemos inferir que mais bibliotecas de raiz em situações contrastantes devam ser geradas, principalmente de genótipos de café resistente e suscetível aos nematóides. Apesar das limitações da biblioteca, foram encontradas seqüências compatíveis ao estresse aplicado. O entendimento da relação com os patógenos e dos mecanismos da resistência do cafeeiro são ainda bastante incipientes, especialmente em relação aos nematóides. Assim, este estudo faz parte da proposta de alguns projetos em execução que utilizam técnicas moleculares como abordagem da interação entre o Meloydogine e o cafeeiro. Com o entendimento dos mecanismos de resposta da planta envolvidos nesta interação, serão isoladas seqüências que possam ser utilizadas para o melhoramento de cultivares e possibilitar a conseqüente obtenção de plantas resistentes.
Construção de bibliotecas de cDNA de diferentes fases da embriogênese somática em café
(2003) Santos, Suzana Neiva; Tinoco, Maria Laine P.; Sá, Maíra Grossi de; Junqueira, Cristina Salgado; Soares, Alexandre F.; Andrade, Alan Carvalho; Teixeira, Joao Batista; Batista, João A. N.; Sá, Maria Fátima Grossi de; Silva, Felipe R. da; Borges, Carlos R.; Romano, Eduardo; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Embriogênese somática (ES) é reconhecida como uma ferramenta biotecnológica importante para regeneração e multiplicação de plantas economicamente importantes. Apesar de café ser uma cultura de alto valor comercial e ES ter sido estabelecida desde 1970, não existem estudos bioquímicos e moleculares que permitam compreender e controlar este processo nesta cultura. O racional deste trabalho é a comparação dos genes que são expressos em genótipos contrastantes (como Coffea arabica e C. canephora) em relação à competência embriogênica e em diferentes fases do processo de ES. Para atingir estes objetivos foram construídas bibliotecas de cDNA de C. arabica e C. canephora nas fases de: folha, folha induzida por 2,4-D, calo primário e calo embriogênico. Dez mil clones advindo destas bibliotecas estão sendo seqüenciados e analisados. A compreensão dos mecanismos que governam o processo de ES se constitui em uma ferramenta valiosa para o melhoramento convencional já que permite a multiplicação de indivíduos F1 advindos de programas de melhoramento. Por outro lado, o controle deste processo também será extremamente importante para introdução de características que aumentem a qualidade da cultura, através de engenharia genética.
Construção de macroarranjos de cDNA de café, para a identificação de genes de interesse agronômico
(2007) Vinecky, Felipe; Vieira, Natália G.; Ferreira, Daniela L.A.; Freire, Luciana P.; Marraccini, Pierre Roger Rene; Silva, Felipe R. da; Andrade, Alan Carvalho; Embrapa - Café
Para a construção dos macroarranjos, foi gerado inicialmente um conjunto não redundante de clones (Unigene), resultante da análise do banco de dados gerado no projeto Genoma Café. Utilizando-se um sistema automatizado para o rearranjo (Q-Bot), um conjunto não redundante com aproximadamente 33 mil clones foi rearranjado, perfazendo um total de 86 placas de 384 poços. O DNA plasmidial de todo esse conjunto de clones (33 mil), foi extraído e amostras representativas de cada uma das placas foi analisada por eletroforese em gel de agarose. Com o objetivo de se ter uma idéia do resultado do rearranjo, 4 clones aleatórios (1 clone/ quadrante de 96) de cada placa de 384 foram seqüenciados e comparados por análises de BlastN na Base de Dados do Genoma Café, para a confirmação da identidade dos clones. Do total de seqüências analisado, verificou-se uma porcentagem de 8% de erros ocorridos no rearranjo. Essas placas foram rearranjadas e amostras, novamente seqüenciadas. Após essa etapa, as membranas serão construídas e o presente trabalho teve como objetivo, avaliar a metodologia para a construção de macroarranjos, em escala piloto, para se determinar as melhores condições para a impressão de DNA nas membranas do Unigene Café. Foram avaliados os parâmetros, tipo de DNA a ser impresso (DNA plasmidial vs. Produto de PCR) e a concentração a ser utilizada. De modo geral, a impressão das membranas utilizando-se o equipamento Q-Bot (Genetix) foi bastante uniforme entre as repetições, apresentando muito baixa variação e como esperado, os sinais radioativos apresentados pelos produtos de PCR, foram superiores aos de plasmídeo, devido à razão molar diferente e provável melhor desnaturação devido ao fato de serem fragmentos de DNA lineares.
Determinação do unigene do Projeto Genoma Café
(2005) Sales, Raphael M. O. B.; Andrade, Alan Carvalho; Silva, Felipe R. da; Embrapa - Café
O Projeto Genoma Café gerou seqüências parciais de mais de duzentos mil clones de EST (Expressed Sequence Tag). Essa estratégia gera dados redundantes. Nesse trabalho, selecionamos o conjunto mínimo de clones que representam todos os transcritos encontrado no projeto. Para tanto, as 213.157 seqüências geradas pelo projeto, apos um processo criterioso que resultou em 145.507 seqüências limpas, foram agrupadas por similaridade dando origem a 32.958 possíveis transcritos, aqui chamados de Unigenes. Para cada Unigene, determinamos o clone correspondente à extremidade 5' o que, pela metodologia empregada na construção das bibliotecas, deve corresponder ao clone de maior extensão. Todos os resultados obtidos foram centralizados e organizados em uma base de dados relacional, de forma a facilitar sua utilização em posteriores aplicações de diferentes plataformas e linguagens. O SGDB usado foi o PostgreSQL. Desenvolvemos uma interface Web usando as linguagens PHP e Perl rodando sobre o Apache para permitir a usuários acesso aos dados de maneira simplificada e rápida. Escolhemos essas ferramentas por serem todas de código livre, permitindo personalizações, se necessárias, e por não agregarem nenhum vinculo de licença.
Expressão de genes em ramos de café depauperado com a presença de Xylella fastidiosa
(2003) Mehta, Angela; Oliveira, Angélica C. de; Eira, Mírian T. S.; Leite, Rui Pereira; Andrade, Alan Carvalho; Silva, Felipe R. da; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
A cultura do café possui grande importância econômica para o Brasil por constituir um dos principais produtos de exportação do país. Os principais problemas relacionados à cultura do café são a ocorrência de estresses bióticos causados por pragas e doenças e estresses ambientais (hídrico, nutricional, etc). Recentemente, foi reportado o depauperamento de plantas de café causado por Xylella fastidiosa. Essa doença vem atingindo todas as regiões produtoras de café no país, causando perdas econômicas apreciáveis, principalmente para o estado de Minas Gerais que é um dos principais produtores desta cultura. O mecanismo de patogenicidade de Xylella fastidiosa ainda não é bem compreendido. A bactéria coloniza os vasos do xilema formando agregados que bloqueiam a passagem de água e nutrientes. Acredita-se que polissacarídeos e enzimas extracelulares tenham um papel importante na colonização dos vasos do xilema. Entretanto, os mecanismos de interação planta-patógeno não são conhecidos. Em 2001 foi iniciado um projeto para o sequenciamento de 200.000 ESTs de café em diferentes situações biológicas. O objetivo principal deste projeto é identificar genes que possam ser utilizados em programas de melhoramento da qualidade e competitividade do café. O presente trabalho teve por objetivo identificar genes expressos em plantas de café depauperadas com a presença de Xylella fastidiosa. Ramos de plantas de café apresentando os sintomas típicos relacionados a Xylella fastidiosa, como internodios curtos, presença de folhas pequenas em tufos, foram coletados. Uma análise preliminar em microscópio foi realizada para verificar a presença da bactéria nos feixes do xilema. Posteriormente, a presença de X. fastidiosa foi confirmada através de PCR utilizando DNA dos ramos e primers específicos para a bactéria. Uma biblioteca de cDNA foi construída a partir deste material vegetal e os resultados preliminares obtidos serão apresentados. Tentativas foram também realizadas para infiltrar a bactéria em radículas de café, uma vez que esta bactéria também já foi isolada de raízes de plantas depauperadas. A presença da bactéria nas radículas foi confirmada através de PCR com primers específicos 10 e 20 dias após a infiltração. Pretende-se analisar a expressão diferencial de radículas infiltradas e sadias na tentativa de se isolar genes relacionados a resposta da planta à presença de X. fastidiosa. Espera-se, com este projeto, que genes relacionados à interação de plantas de café com Xylella fastidiosa sejam identificados de maneira a contribuir em programas de melhoramento.
Identificação de ESTS tecido-específicas no banco de dados do genoma funcional de Coffea spp.
(2007) Santos, Daiene B. M.; Almeida, Juliana Dantas de; Barros, Leila M. G.; Carneiro, Mauro; Silva, Felipe R. da; Embrapa - Café
O projeto Brasileiro Genoma Café foi elaborado e executado com o objetivo de fornecer informações sobre o genoma do cafeeiro aos pesquisadores que desenvolvem variedades melhoradas, em busca da produtividade e qualidade de grãos. Nesse projeto foram seqüenciados 218.150 clones distintos de ESTs (Expressed Sequenced Tags) escolhidos aleatoriamente em 49 bibliotecas de cDNA de C. arabica, C. canephora e C. racemosa, as quais representam diferentes tecidos em estágios específicos de desenvolvimento e tecidos submetidos a estresses biótico e abiótico. Após a remoção de contaminações e seqüências de baixa qualidade, as 154.770 ESTs restantes foram agrupadas em 45.366 clusters (UniGenes), dos quais cerca de 27% não apresentam similaridade significativa com seqüências protéicas já descritas. A fim de selecionar genes preferencialmente expressos na raiz, no fruto, na folha e no botão floral, realizamos uma análise in silico, visando a prospecção dos seus respectivos promotores em um próximo passo. Para tal, foram feitas comparações por meio do Teste Exato de Fisher, entre grupos formados por bibliotecas de ESTs obtidas a partir de um único tipo de tecido e grupos formados pelas bibliotecas restantes, tendo-se como resultado a seleção de UniGenes que possuem grande chance de serem tecido-específicos. Dessa forma, foram selecionados 103 UniGenes que apresentam níveis significativamente distintos de transcritos oriundos de cada um dos tecidos, sendo 18 de folhas, 40 de frutos, 14 de raiz e 31 de botões florais. Dentre os Unigenes selecionados, foram escolhidos três de cada um dos tecidos e um constitutivo para as validações experimentais. O critério de escolha desses Unigenes se baseou no grau de ineditismo, na especificidade dos unigenes e no nível de expressão. Para confirmar o caráter de tecido especificidade dos genes escolhidos, serão realizadas análises de Real Time RT-PCR e Northern blot.