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Aspectos bioquímicos e moleculares da resistência sistêmica adquirida em cafeeiro contra Hemileia vastatrix
(Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São Paulo, 2004-06) Guzzo, Sylvia Dias; Tsai, Siu Mui
Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e β-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S- metil (ASM) (200 μg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e β-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 μg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de β-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos.
Aspectos bioquímicos em plantas de cafeeiro tratadas com silício
(Centro de Energia Nuclear na Agricultura - Universidade de São Paulo, 2008-02) Martinati, Juliana Camargo; Tsai, Siu Mui
A maioria das plantas consegue defender-se contra infecções fúngicas por meios naturais, que podem ser induzidos por uma série de elicitores bióticos ou abióticos. O silício (Si) solúvel tem mostrado que é capaz de induzir resistência em várias espécies de plantas contra inúmeros patógenos. Neste trabalho foi proposta a avaliação dos compostos contento Si na redução dos sintomas da ferrugem causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix em plantas de cafeeiros suscetíveis bem como avaliar os parâmetros bioquímicos envolvidos nos processos de resistência. Primeiramente, foram estudadas duas fontes de Si (silicato de Ca/Mg e silicato de potássio) em cinco doses para padronizar uma dose/fonte para os experimentos futuros. Foi possível observar que as plantas de cafeeiros não tiveram diferença significativa nos parâmetros de desenvolvimento como altura das plantas, área foliar, número de folhas para nenhuma das fontes e doses analisadas. Porém quando se tratava da contagem do número de lesões por cm 2 , a fonte silicato de potássio na dose de 5mM conseguiu suprimir em até 60% o desenvolvimento das lesões causadas pelo fungo. Com a fonte e dose estabelecidas, o segundo passo do trabalho foi avaliar quais os processos bioquímicos envolvidos na resistência conferida pelo Si em plantas de cafeeiro. Foram analisadas as atividades das enzimas relacionadas ao estresse oxidativo (peroxidases guaiacol e ascorbato, catalases, e superóxido desmutases) e relacionadas à defesa (glucanase, quitinase e PAL). As folhas foram coletadas para a obtenção do extrato protéico em diferentes intervalos de tempo após a inoculação com o fungo: as 24, 48, 72 e 96 horas após a inoculação e como controle foi utilizado o tempo zero (sem inoculação). Nesta fase foi possível observar que a atividade das enzimas CAT, SOD, APX foi maior em plantas tratadas indicando que o Si parece estimular uma resposta mais rápida ao estresse oxidativo. O mesmo ocorreu com as enzimas relacionadas à defesa. A partir destes resultados podemos afirmar que o Si estimula uma resposta de defesa mais rápida em plantas de café suscetíveis à ferrugem quando inoculadas com o fungo patogênico.
Identificação de genes de cafeeiro relacionados à resistência sistêmica adquirida e à resistência vertical
(2003) Guzzo, Sylvia D.; Harakava, Ricardo; Tsai, Siu Mui; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do Café
Com o objetivo de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos de resistência de cafeeiros contra doenças, genes relacionados à resistência sistêmica adquirida (RSA) e à resistência vertical (RV) foram identificados através da técnica de hibridização subtrativa por supressão (HSS). Para o isolamento de genes relacionados à RSA, cafeeiro cv. Mundo Novo foi tratado com o indutor benzotiodiazol (BTH) na concentração de 400 ppm. Após 72h, RNA total foi extraído de folhas de plantas tratada e controle e convertido em cDNA. Através da HSS, produziu-se uma biblioteca subtraída enriquecida de fragmentos de genes induzidos pelo BTH. Para o isolamento de genes relacionados à RV, cafeeiro Híbrido de Timor foi inoculado com urediniosporos de Hemileia vastatrix. Após 72h, seguindo a mesma metodologia anteriormente descrita, produziu-se uma biblioteca subtraída enriquecida de fragmentos de genes induzidos durante a resposta de resistência. Para confirmar que os clones continham fragmentos de genes especificamente induzidos nas condições estudadas, realizou-se seleção diferencial através de hibridização com sondas de cDNAs de plantas tratada e controle. Foram sequenciados 384 clones de cada biblioteca. As sequências obtidas foram comparadas com aquelas presentes no GenBank utilizando-se o programa BLASTX. Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio ativadas, apoptose, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal e síntese de proteínas relacionadas à patogênese.