UFV - Teses
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Item Caracterização molecular e resistência a doenças de genótipos de cafeeiros originários da América Central(Universidade Federal de Viçosa, 2022-04-01) Granados Brenes, Eduardo; Zambolim, Laércio; Caixeta, Eveline TeixeiraA cultura do café tem apresentado uma série de doenças que provocam severos danos na cafeicultura de diversos países. Visando minimizar esses problemas, programas de melhoramento genético têm desenvolvido cultivares com resistência à fatores bióticos e abióticos. No entanto, o uso dessa cultivares associado a autogamia e origem do cafeeiro arábica tem resultado em estreita relação genética entre os genótipos e, consequentemente, maior vulnerabilidade a doenças e pragas. Técnicas tradicionais de inoculação do patógeno complementadas com a biologia molecular permitem verificar a presença de genes que conferem resistência a ferrugem (Hemileia vastatrix), principal doença da cultura, e ao Colletotrichum kahawae causador da antracnose verde dos grãos, além de auxiliar o estudo de diversidade das cultivares. Marcadores ligados a genes que conferem resistência a doenças, complementam os trabalhos clássicos de fenotipagem das plantas de café na determinação da resistência ou a susceptibilidade a patógenos. Diante desse panorama, esse trabalho teve como objetivo a verificação da diversidade genética das cultivares de café da América Central, utilizando 16 marcadores microssatélites distribuídos aleatoriamente no genoma de C. arabica. Além disso, a resistência dessas cultivares foi verificada por meio da fenotipagem com as raças II e XXXIII de H. vastatrix e genotipagem com marcadores moleculares ligados a genes de resistência a H. vastatrix e a C. kahawae. As análises moleculares com marcadores aleatórios revelaram diversidade entre e dentro das cultivares analisadas, sendo possível obter o padrão molecular da maioria delas. Essas análises permitiram também observar erros de identificação de cultivar, misturas ou hibridações nas cultivares. Das 36 cultivares fenotipadas para resistência, 30 foram resistentes a raça II e 26 a raça XXXIII de H. vastatrix. Na genotipagem, os cafeeiros apresentaram variabilidade e alelos que conferem resistência a H. vastatrix, complementado os resultados fenotípicos, sugerindo uma piramidação de genes de resistência nos cafeeiros da América Central. Palavras-chave: Coffea arabica. Hemileia vastatrix. Colletotrichum kahawae. Seleção assistida por marcadores moleculares. Diversidade genética.Item Abordagens fenotípicas e moleculares aplicadas à seleção de cafeeiros arábica com resistência múltipla a estresses bióticos(Universidade Federal de Viçosa, 2022-02-25) Feitosa, Francielle de Matos; Caixeta, Eveline TeixeiraO café é a segunda principal commodity no mercado mundial. A espécie Coffea arabica é uma das principais espécies cultivadas no mundo. No entanto, a cultura hospeda uma grande variedade de patógenos e pragas. Os patógenos Hemileia vastatrix e Colletotrichum kahawae são as doenças mais importantes da cultura, e a praga bicho-mineiro, impacta severamente a produtividade e qualidade de bebida. Assim, como forma de controle, o desenvolvimento de cultivares resistentes, com a utilização de marcadores moleculares auxiliam no progresso de melhoramento genético da cultura. O objetivo do trabalho foi identificar cafeeiros portadores de genes de resistência para as principais doenças do café; determinar a diversidade genética por meio de características morfológicas e estimar os parâmetros genéticos e os ganhos com a seleção utilizando a metodologia de modelos mistos (REML/BLUP). O estudo foi composto por duas populações, a primeira, os cafeeiros em geração F 2 são provenientes do cruzamento entre cultivar resistente a ferrugem e CBD e outra ao bicho-mineiro, enquanto que a segunda, são originados de cruzamentos de cafeeiros arábicas com fontes de resistência (seleção indiana). A identificação de cafeeiros resistentes foi feita fenotipicamente e/ou molecularmente. A análise de diversidade genética foi baseada na distância generalizada de Mahalanobis e a seleção fenotípica, por meio do procedimento REML/BLUP. Ambas populações apresentaram resistência múltipla para as principais doenças com diferentes combinações. Com base nas análises utilizando o método REML/BLUP, foi possível selecionar cafeeiros promissores por serem geneticamente divergentes e complementares pela análise de agrupamento e por proporcionar ganhos com a seleção principalmente para a característica infestação de bicho- mineiro. Além disso, foi possível observar que os materiais em desenvolvimento apresentam superioridade em relação as cultivares comerciais. Palavras-chave: Hemileia vastatrix. Colletotrichum kahawae. Melhoramento preventivo. Piramidação de genes.Item Variabilidade patotípica de Hemileia vastatrix e resistência do cafeeiro a ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2018-12-10) Perla, Manuel de Jesus Deras; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berk. & Br., é a principal doença em todos os países produtores de café no mundo. No Brasil, a doença causa perdas entre 35% e 50% e, na América Central e Colômbia, entre 20% e 80%. O Brasil possui o maior banco de germoplasma com acessos derivados do Híbrido de Timor (HDT), na Universidade Federal de Viçosa (UFV), o qual vem sendo utilizado e, ao longo dos anos, tem sido valioso para os programas de melhoramento, visando encontrar cultivares com resistência durável à ferrugem. Cultivares com resistência à ferrugem geradas por diferentes institutos de melhoramento genético de café no Brasil foram avaliadas em campo para conhecer seu comportamento em diferentes ambientes. As epidemias registradas na América Central de 2011 a 2013 foram decorrentes de diferentes fatores econômicos, ambientais e, possivelmente, do surgimento de novas raças de H. vastatrix; a suplantação da resistência de cultivares de café lançadas como resistentes à ferrugem no mundo todo também constitui um problema para os programas de melhoramento genético. Diante desses fatos, este estudo teve como objetivos: (i) avaliar fenotipicamente os acessos de HDT; (ii) estudar o comportamento de cultivares lançadas como resistentes pelos diferentes programas de melhoramento genético do Brasil; (III) avaliar a resistência de 12 cultivares às raças II (v 5 ) e XXXIII (v 5 , 7 , 9 ) de H. vastatrix; (IV) avaliar o teor de clorofila das cultivares resistentes à ferrugem; e (V) caracterizar as raças de H. vastatrix Berk. & Br. presentes em Honduras. A avaliação dos HDTs foi realizada no viveiro de café do Departamento de Fitopatologia da UFV. Para avaliação das cultivares com resistência à ferrugem, foram conduzidos experimentos em campo, em Varginha e Viçosa, no Estado de Minas Gerais. A caracterização de raças de H. vastatrix foi desenvolvida no Instituto Hondurenho do Café (IHCAFE), em Honduras. Vinte e oito cultivares lançadas como resistentes foram estudadas durante oito anos. Os testes visando avaliar a resistência de 12 cultivares às duas raças de H. vastatrix foram conduzidos em câmaras de incubação. O teor de clorofila a, b, total e carotenoides foi determinado nas 28 cultivares. Para caracterização de raças de H. vastatrix, isolados do patógeno foram coletados em lavouras de café em Honduras, nas cultivares Lempira e Catuaí vermelho, em diversas altitudes. A caracterização fisiológica de raças do patógeno foi baseada na ausência (resistente) ou presença (suscetível) de uredósporos nos discos foliares dos clones diferenciadores. Os resultados da avaliação dos acessos de HDT, utilizando a rede de correlações, mostrou que houve correlações significativas diferentes de zero nas características vigor, produção, diâmetro de copa e altura das plantas. Nos testes de cultivares resistentes à ferrugem, verificou-se predominância da resistência quantitativa, além de algumas cultivares terem apresentado tolerância à ferrugem. Cerca de 38,4% das cultivares avaliadas foram resistentes à raça II (v 5 ) e 100% suscetíveis à raça XXXIII (v 5 , 7 , 9 ) de H. vastatrix. Quanto aos teores de clorofilas e carotenoides, houve grande variação dos valores entre os genótipos, porém não foi observada correlação com a produtividade e a incidência da ferrugem. Diante da rápida suplantação da resistência qualitativa das cultivares de café lançadas, recomenda-se buscar nos genótipos de café características de tolerância à doença, pelo fato de ser duradoura. Em se tratando da caracterização de raças de H. vastatrix, não foi possível enquadrar nenhuma das combinações dos genes de virulências dos isolados em raças patogênicas. Comprovou-se, portanto, a suplantação da resistência da variedade Lempira pelo fungo e foi feita a identificação de 16 patótipos do patógeno.Item Caracterização de raças fisiológicas e análise de proteínas candidatas a efetoras em população de Hemileia vastatrix no Brasil(Universidade Federal de Viçosa, 2017) Silva, Rosemeire Alves; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix Berkeley & Broome, é considerada a principal doença da cultura. O fungo está amplamente distribuído nas regiões produtoras de café, causando severos danos econômicos. Novas raças fisiológicas de H. vastatrix tem surgido, com frequência em todo mundo, infectando algumas cultivares de café lançadas comercialmente como resistentes à ferrugem. Dessa forma, a obtenção de cafeeiros resistentes tem sido um desafio devido ao alto potencial adaptativo do fungo e tem se tornado cada vez mais difícil a caracterização dos patótipos por meio da coleção de cafeeiros diferenciadores de raça. Além disso, as informações acerca da interação de cafeeiros com as raças existentes são escassas, embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado. Estudos genômicos estão ajudando no entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de interação entre planta e patógeno e no desenvolvimento de técnicas moleculares para a identificação de isolados. Nosso objetivo foi caracterizar as raças de H. vastatrix encontradas nas principais regiões produtoras de café do Brasil, e estudar as proteínas candidatas a efetoras preditas para H. vastatrix que possam contribuir para patogenicidade nas diferentes raças do fungo. Foram utilizados 56 isolados monopustular coletados de diferentes espécies de café, Coffea canephora, C. arabica e Híbrido de Timor (C. canephora x C. arabica) e multiplicados em cafeeiro suscetível C. arabica variedade Caturra. Cada isolado foi inoculado em cafeeiros que compõe a série diferenciadora de raças, com três repetições. O DNA dos 56 isolados monopustulares foram extraídos para os estudos genômico. Foram utilizadas 47 combinações de primer para amplificar genes de candidatos a efetores. Sete genes foram amplificados, sequenciados e tiveram sua expressão validada em cafeeiros resistente e suscetível. As sequências obtidas foram alinhadas para os 46 isolados, usando o programa DNA Baser. Estudo de domínio conservado foram realizados no programa Pfam e a categorização das proteínas no Blast2GO. O alinhamento das sequências de nucleotídeos, proteínas e agrupamento dos isolados foi feito no programa Clustalw e as diferença de nucleotídeo foi analisada no Weblogo. Os dados obtidos foram usados para o estudo de diversidade. Por meio da inoculação na série diferenciada, foram identificadas sete raças, sendo cinco já descritas no Brasil e duas pela primeira vez (raça XXIX e XXX). Não foi possível caracterizar 15 combinações dos genes de virulência, sendo assim consideradas novas raças. A análise da coleção de isolados permitiu inferir a presença de pelo menos seis novos genes na série diferenciadora, o que possibilitou diferenciar dois isolados descritos como raças III. Na análise genômica, os 47 genes candidatos a efetores estudados se mostraram conservados em todos os isolados e estão ligados a 15 processos biológicos do desenvolvimento do fungo. Foram identificados 14 domínios nas proteínas provenientes desses genes. Para os sete genes sequenciados nos diferentes isolados, observou-se diferença na sequência dos nucleotídeos e presença de indivíduos heterozigoto e homozigoto. Com análise de diversidade foi possível discriminar os indivíduos, sendo o isolado Hv-09 o mais divergente. As informações geradas nesta pesquisa poderão ampliar o entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes que estão envolvidos no processo infeccioso auxiliará o entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.Item Transcriptoma do cafeeiro (Coffea arabica L.) durante a interação com Hemileia vastatrix Berk. & Br(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-16) Flórez Varon, Juan Carlos; Caixeta, Eveline TeixeiraO cafeeiro é uma das culturas mais importantes no mundo, porém, é atacada por diversas doenças, sendo a ferrugem, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, considerada a principal doença em todas as regiões produtivas. O estudo do transcriptoma do cafeeiro durante a interação com H. vastatrix pode auxiliar no controle dessa doença pelo entendimento de quais mecanismos de defesa a planta esta ativando. Em um patossistema, entender a expressão gênica é essencial para a identificação dos genes relacionados com os mecanismos de defesa e resistência da planta, que são ativados pelos genes de patogenicidade do agente causal. Esses genes identificados podem ser utilizados para obtenção de cultivares resistentes. Para estudar o transcriptoma de um organismo, o método que tem sido utilizado é o sequenciamento de mRNA, denominado RNA-Seq. Esta abordagem permite monitorar a expressão de genes da planta e do patógeno em diferentes etapas ao longo do processo infeccioso. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi estudar o transcriptoma do cafeeiro durante a interação com H. vastatrix, fungo causador da ferrugem, a fim de identificar os genes que são ativados ou reprimidos em resposta à infecção. Folhas dos cafeeiros C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1 (suscetível) e Híbrido de Timor CIFC 832/1 (resistente) foram inoculadas com urediósporos da raça XXXIII de H. vastatrix e coletadas em diferentes tempos após a inoculação (12, 24, 96 horas e 17 dias). Como controle, foram utilizadas folhas dos dois genótipos de café inoculados com água. Após a extração do RNA das amostras, foram obtidas as bibliotecas de cDNA, que foram sequenciadas usando a plataforma Illumina Miseq. As análises dos dados foram realizadas utilizando ferramentas de bioinformática e consistiram em: i) avaliação da qualidade das sequências com o programa FastQC; ii) limpeza dos dados e sobreposição de reads de acordo com os critérios de qualidade, usando Pear e Clean Solexa; iii) mapeamento dos transcritos com o genoma de referência de Coffea canephora e montagem de novo como estratégia complementar; iv) analise de expressão diferencial de genes; v) anotação; e vi) validação de genes candidatos por PCR em tempo real. Um total de 43.159 contigs foram obtidos após o mapeamento contra C. canephora e a montagem de novo. Os resultados sugerem que durante a infecção inicial (12 e 24 hai), o Híbrido de Timor (HdT) foi mais responsivo ao ataque de H. vastatrix em relação ao Caturra por apresentar maior número de genes up-regulated. Foram selecionados treze genes (up- regulated) exclusivos do HdT, para avaliar o padrão de expressão com o uso de qPCR. As estratégias utilizadas para a montagem do transcriptoma foram eficientes e permitiram a obtenção de um banco de dados com qualidade, o qual poderá ser utilizado para mineração de genes expressos no patossistema C. arabica-H. vastatrix durante a infecção.Item Identification, molecular characterization and differential expression studies of genes activated during Coffea arabica L. - Hemileia vastatrix interactions Berk. & Broome(Universidade Federal de Viçosa, 2017-02-20) Barka, Geleta Dugassa; Caixeta, Eveline TeixeiraO café é uma das culturas de maior valor econômico mundial, além de proporcionar e qualidade de vida para milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Embora existam vários programas de melhoramento para essa cultura e cultivares comerciais disponíveis que apresentam fatores de resistência a estresse biótico, verifica-se ainda prejuízos significativos devidos à ferrugem do cafeeiro causada por Hemileia vastatrix. A compreensão dos mecanismos moleculares da resistência à ferrugem desempenha papel importante na eficiência do desenvolvimento de novas cultivares resistentes. O objetivo do presente trabalho é identificar, caracterizar e compreender os padrões de expressão de genes de resistência do cafeeiro que são ativados após inoculação com H. vastatrix. Foi utilizada a metodologia de Hibridação Subtrativa de Supressão (HSS) para identificar os genes diferencialmente expressos (upregulated e dowregulated) às 12 e 24 horas após inoculação (h.a.i.) de Coffea arabica com o patógeno, em interações compatíveis e incompatíveis. A partir de 433 clones obtidos e sequenciados, 352 foram anotados e categorizados. Observou-se proporção relativamente menor de genes expressos em interação compatível. A análise RT-qPCR de sete genes de sinalização de resistência mostrou padrões de expressão semelhantes para a maioria dos genes em ambas as interações, indicando que esses genes estão envolvidos na resistência (não específica) durante a qual as reações imunes são semelhantes. Na segunda etapa do trabalho, resistance gene analogs (RGAs), que conferem resistência à ferrugem do café, foram identificados, sequenciados e caracterizados a partir de uma biblioteca BAC do cafeeiro. Cinco RGAs foram anotados e mapeados no cromossomo 0 (zero) de C. canephora. Destes, quatro RGAs são ativados na interação incompatível entre C. arabica e H. vastatrix. Os resultados obtidos no trabalho sugerem que um desses genes RGA sequenciado (gene 11) é um novo gene S H (S H 10) ainda não identificado biologicamente. Com base nesses dados, foi verificado pela primeira vez o novo gene S H (S H 10) no clone diferenciador 644/18 H. Kawisari. Foi realizado a análise comparativa entre os cincos RGAs e verificado alta similaridade entre dois destes, os quais são pertencentes à família de genes CC-NBS-LRR. Foi verificado intensa seleção diversificada promovida pela substituição não sinônima e pela recombinação genética. Foi realizada a análise filogenética de genes ortólogos para as espécies de café, tomate e uva e observou-se alta variabilidade intraespecífica destes dois genes CC-NBS-LRR para as espécies, exceto para o café. Estes genes sequenciados são as maiores e mais completas sequências disponíveis para o C. arabica. Estes resultados são de extrema importância para o melhoramento genético molecular visando a resistência à ferrugem do cafeeiro. De modo geral, a compreensão dos padrões de expressão de genes de resistência e a caracterização molecular de novos RGAs são resultados valiosos e estabelece nova base para estudos futuros.Item Análise citológica e perfil de expressão gênica de Hemileia vastatrix (raça XXXIII) na interação com o cafeeiro(Universidade Federal de Viçosa, 2015-08-12) Lopes, Rejane do Livramento Freitas; Sakiyama, Ney SussumuA raça XXXIII de Hemileia vastatrix foi recentemente identificada no Brasil, infectando algumas cultivares resistentes à ferrugem do cafeeiro. Embora o processo infeccioso de H. vastatrix seja bem estudado, não existem informações acerca da interação de cafeeiros com esta raça do fungo. Diante disso, um dos objetivos deste trabalho foi avaliar o processo de colonização do fungo e as respostas de defesa da planta em genótipos de cafeeiro resistente (Híbrido de Timor – HDT CIFC 832/1) e suscetível (C. arabica cv. Caturra CIFC 19/1) infectados pela raça XXXIII. As primeiras respostas citológicas induzidas pelo fungo foram observadas particularmente nas células estomáticas de ambos os genótipos, às 17 horas após inoculação (hai), e corresponderam à morte celular e ao acúmulo de compostos fenólicos. No genótipo suscetível, o fungo foi capaz de colonizar os tecidos do hospedeiro e produziu um grande número de haustórios, culminando na esporulação cerca de 20 dias após a inoculação (dai). Ao contrário, no genótipo resistente, o crescimento do fungo foi impedido, com alta frequência no estádio pré-haustorial. Estas observações citológicas indicam que a resistência de HDT CIFC 832/1 à raça XXXIII de H. vastatrix é pré-haustorial, ao contrário da resistência pós-haustorial que é geralmente descrita para interações cafeeiro - H. vastatrix. Com base nesta análise, foram definidos os tempos mais adequados para o estudo de genes expressos ao longo do processo infeccioso. Embora o sequenciamento do transcriptoma tenha sido bastante utilizado em estudos de interação planta-patógeno, uma das maiores dificuldades consiste na separação dos transcritos provenientes da planta e do fungo, principalmente quando não existe genoma de referência. Por esta razão, foi realizado o sequenciamento e a montagem do transcriptoma de esporos hidratados e germinados da raça XXXIII de H. vastatrix. A montagem resultou em 32.882 contigs, a partir dos quais foi gerado um conjunto de 11.989 genes preditos. Plantas de C. arabica cv. Caturra Vermelho (CIFC 19/1) e Híbrido de Timor (CIFC 832/1) foram inoculadas com esporos frescos de H. vastatrix (raça XXXIII) para estabelecer uma interação compatível e incompatível, respectivamente. Como controle, foram utilizadas folhas não inoculadas. Nos tempos de coleta pré-definidos (12, 24, 96 horas e 17 dias após a inoculação), as folhas foram removidas e utilizadas para extração de RNA. O sequenciamento das dez bibliotecas de cDNA foi realizado na plataforma Illumina MiSeq, gerando um total de 206 milhões de reads. Após tratamento dos reads, foi realizado o mapeamento das bibliotecas da interação, utilizando como referência o transcriptoma de H. vastatrix previamente montado. Os dados obtidos mostraram que muitos genes de H. vastatrix são similares aos genes do cafeeiro, o que dificulta o estudo da expressão de genes na interação. Por outro lado, genes não conservados entre os dois organismos puderam ser avaliados quanto à sua expressão. Foi verificada a presença de muitos genes comuns às duas interações (compatível e incompatível), sendo que a grande maioria não apresentou expressão diferencial, principalmente nas fases iniciais do processo infeccioso. As maiores diferenças entre as interações foram encontradas aos 17 dai, consistindo principalmente de genes “no hit”, ou seja, genes que não apresentam similaridade com sequências dos bancos de dados de proteínas. Estas sequências podem corresponder a genes específicos de H. vastatrix. As informações geradas nesta pesquisa poderão auxiliar no melhor entendimento da interação entre H. vastatrix e o cafeeiro. O conhecimento dos genes expressos durante a infecção poderá auxiliar no entendimento dos mecanismos moleculares que levam à suplantação da resistência por novas raças do fungo.