SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Bandeamento NOR e coloração com laranja de acridina em cromossomos metafásicos obtidos de agregados celulares de Coffea canephora(2003) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Fontes, Marcelo A.; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO gênero Coffea pertence à Família Rubiaceae, e apresenta duas espécies de grande importância econômica: Coffea arabica e Coffea canephora. Coffea canephora apresenta 2n=22 cromossomos, sendo um par de cromossomos metacêntricos (número 1), 10 pares de cromossomos submetacêntricos (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11) e um par de cromossomos que possuem, no braço curto, um satélite associado à constrição secundária (6). Este estudo teve como objetivo aplicar técnicas de bandeamentos em cromossomos metafásicos de C. canephora para verificar se constrição secundária, evidenciada no cromossomo número 6, corresponde à região organizadora do nucléolo (NOR). Agregados celulares em suspensão foram obtidos a partir de explantes foliares de C. canephora. Esses agregados foram cultivados em meio estéril de manutenção, em agitador, com ciclos de 110 rpm, à temperatura ambiente. Para obtenção de cromossomos metafásicos, foram adicionados 125 ml de amiprofos-metil (APM) 0,1 mM para cada 50 ml de meio de cultura, resultando numa concentração final de 3,0 mM. Após 4 h de bloqueio, os agregados foram retirados, fixados em solução de metanol:ácido acético (3:1) e armazenados à -20º C. As preparações citogenéticas foram realizadas pela técnica dissociação celular com digestão enzimática Flaxzym â (NOVO), secagem ao ar e coradas com solução de Giemsa 3%, em tampão fosfato pH 6,8, por 3 min. Algumas lâminas foram descoradas com soluções de metanol:ácido acético (3:1) e armazenadas em estufa a 37 0 C, por 7 dias. Após o período de envelhecimento, as lâminas foram tratadas com tampão fosfato, pH=6,5, a 85º C, por 20 min. Em seguida, foram coradas com solução de laranja de acridina a 0,01%, por 15 min, em câmara úmida, e, posteriormente, lavadas e água destilada por 1 min, 2 min e em tampão fosfato por 3 min. Três gotas de tampão fosfato foram adicionadas entre lâmina e lamínula. A técnica clássica de bandeamento NOR foi realizada gotejando-se solução de AgNO3 50% sobre lâminas não coradas. Logo após, as mesmas foram cobertas com lamínulas e colocadas em câmara úmida a 34º C, por 18 h. Decorrido o tempo de armazenamento, as lamínulas foram retiradas com jatos de água e as lâminas, lavadas em água corrente e destilada por 2 min. As preparações foram observadas com objetiva de imersão (100X) e as figuras cromossômicas capturadas com sistema digital de análise de imagem acoplado ao microscópio. O tratamento com APM possibilitou a obtenção de metáfases com cromossomos morfologicamente definidos, alongados e não sobrepostos, permitindo a montagem do cariograma da espécie. Identificou-se a presença de satélite associado à região da constrição secundária, no braço curto do sexto par de homólogos, sugerindo que esta constrição seja a NOR. A marcação positiva, evidenciada pela técnica de bandeamento NOR (Ag-NOR), confirmou que está região é a NOR. A coloração com laranja de acridina revelou uma fluorescência mais intensa nas regiões flanqueadoras da NOR, indicando que estas regiões são heterocromáticas ricas em GC. Com base nos resultados obtidos, pôde-se concluir que a constrição secundária do cromossomo número 6 corresponde à NOR, evidenciada pela técnica Ag-NOR, e que esta região também pode ser identificada pela coloração com laranja de acridina.Item Análise de híbridos interespecíficos em Coffea por citometria de fluxo(2003) Fontes, Bárbara Pereira Dantas; Carvalho, Carlos Roberto de; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféMétodos de análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo foram originalmente desenvolvidos para estudos em células humanas. Esta metodologia é baseada no uso de fluorocromos DNA-específicos e na análise da intensidade de fluorescência do núcleo corado. Em plantas, a introdução desta metodologia tem sido adaptada para as mais diversas análises, principalmente para avaliação de ploidia, quantificação do tamanho genômico, variações da quantidade de DNA intra e inter-específicas, apoptose, e correlações da quantidade de DNA com variações ambientais. Em estudos de melhoramento genético de plantas, a citometria de fluxo tem sido utilizada principalmente no monitoramento e identificação de híbridos. No presente estudo, amostras das espécies C. racemosa (2x), C. arabica (4x), dos supostos híbridos interespecíficos UFV 557 e das plantas H920, resultantes do retrocruzamento entre C. arabica e UFV 557.3, tiveram seus conteúdos de DNA estimados por citometria de fluxo. Folhas jovens e vigorosas das plantas foram previamente lavadas, acondicionadas em recipiente contendo água destilada e mantidas a 4°C. Após a assepsia, fragmentos de 2 cm 2 foram cortados, com auxílio de uma lâmina de barbear, em 1 mL de solução tampão de lise. A suspensão foi filtrada em uma tela de 30 µm de diâmetro, e transferida para tubos de Eppendorf. Após centrifugação, o sobrenadante foi removido e a camada de núcleos ressuspendida em tampão. A suspensão nuclear foi corada com solução 15 µM de 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), por 10 a 15 minutos, no escuro, e analisada por um citômetro de fluxo equipado com três parâmetros e lâmpada HBO, de arco de mercúrio 100 W, para excitação em UV. Amostragens com coeficientes de variação acima de 3.06% foram desconsideradas. Os valores de DNA estimados para as plantas UFV 557.1; UFV 557.2; UFV 557.3; UFV 557.4; UFV 557.6 foram de 1.95 a 1.97 pg, intermediários aos valores de C. racemosa (2x=1.11 pg) e C. arabica (4x= 2.77 pg), confirmando o caráter triplóide das plantas UFV 557. Os híbridos obtidos entre C. arabica e UFV 557.3 apresentaram valores de 2.75 a 2.79 pg, próximos ao valor do tetraplóide. Os resultados obtidos confirmaram que a citometria de fluxo é uma metodologia importante no monitoramento e identificação de híbridos de Coffea em programas de melhoramento.