SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Caracterização de promotores de Coffea spp. via transformação genética em planta modelo(Embrapa Café, 2019-10) Girotto, Larissa; Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryoshi, Caroline; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioAs mudanças climáticas globais têm causados danos a produtividade agrícola cafeeira com impactos econômicos e sociais, e apresentam o potencial de reduzir áreas disponíveis para o plantio de cafeeiros. Diante deste cenário foi investigado o potencial do promotor da galactinol sintase (GolS) do gênero Coffea, que catalisa a primeira etapa da via de síntese de oligossacarídeos da família da Rafinose, cujo acúmulo ocorre principalmente em resposta a estresses abióticos. Entender a estrutura e composição de sequências gênicas promotoras de cafeeiros é de fundamental importância para compreender melhor os mecanismos genéticos e os processos de regulação da expressão gênica induzidos em períodos de estresse hídrico e salino. Neste estudo identificamos 14 promotores GolS presentes nos genomas de Coffea arabica, C. canephora e C. eugenioides. Dentro das regiões promotoras desses genes, foram observados 12 cis-elementos relacionados a regulação de genes em resposta a condições adversas, dentre eles: ARE, ABRE, MYB e STRE. Após a caracterização in silico dos 14 promotores, o promotor da isoforma de GolS3 (CcGolS3) de Coffea canephora (Cc) foi clonada com o objetivo de verificar o seu comportamento frente a estresses abióticos. Plasmídeos contendo a construção pCcGolS3::GUS (gene repórter da β-glucuronidase) foram inseridos em Arabidopsis thaliana via transformação genética com Agrobacterium tumefaciens. A coloração histoquímica do gene repórter GUS foi verificada em todos os tecidos de A. thaliana transformadas. Para analisar o comportamento deste promotor, as plantas de A. thaliana foram submetidas a estresses hídrico e salino in vitro (0h, 12h, 24h e 48h), os seus respectivos RNAs foram extraídos e a síntese de cDNA foi realizada para a quantificação da atividade transcricional do gene repórter GUS via RT-qPCR. Os nossos resultados indicaram que o promotor de CcGolS3 pode ser caracterizado como do tipo estresse-induzido, visto que o perfil transcricional do gene GUS diretamente proporcional ao tempo de duração dos estresses. O promotor do gene CcGolS3 apresenta um grande potencial para ser utilizado em projetos futuros de melhoramento genético de cafeeiros e obtenção de plantas mais tolerantes a estresses abióticos.Item Transcriptoma de C. arabica L. revela diferenças na expressão de genes envolvidos na biossíntese da rafinose(Embrapa Café, 2019-10) Ivamoto-Suzuki, Suzana Tiemi; Reis Junior, Osvaldo; Domingues, Douglas Silva; Santos, Tiago Benedito dos; Oliveira, Fernanda Freitas de; Girotto, Larissa; Ariyoshi, Caroline; Pot, David; Leroy, Thierry; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Carazzolle, Marcelo Falsarella; Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães; Pereira, Luiz Filipe ProtasioCoffea arabica L. é uma cultura importante em vários países em desenvolvimento. Apesar de sua importância econômica, os dados do transcriptoma mínimo estão disponíveis para tecidos de frutas, especialmente o perisperma, onde vários compostos relacionados à qualidade do café são produzidos. Para compreender os aspectos moleculares relacionados ao desenvolvimento de frutos e grãos de café, relatamos uma análise transcriptoma em larga escala de folhas, flores e frutos. O sequenciamento da Illumina (RNA-seq) resultou em 41.881.572 sequências trimadas com alta qualidade. A montagem de novo gerou 65.364 unigenes com um comprimento médio de 1.264 pb. Um total de 24.548 unigenes foram anotados como genes codificadores de proteínas, dos quais 12.560 sequências eram completas para esta codificação (full lenghts). No processo de anotação, identificamos nove genes candidatos relacionados à biossíntese de oligossacarídeos da família da rafinose (RFOs). Estes açúcares conferem osmoproteção e são acumulados durante o desenvolvimento inicial dos frutos. Quatro genes dessa via tiveram o seu padrão transcricional validado pela reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa quantitativa em tempo real (RT-qPCR). Este atlas transcriptômico de C. arabica fornece um importante passo para a identificação de genes candidatos relacionados a diversas vias metabólicas do café, especialmente aquelas relacionadas à composição química dos frutos e a qualidade da bebida. Nossos resultados são o ponto de partida para aumentar o conhecimento sobre as proteínas do café que são produzidas durante os estádios de floração e desenvolvimento inicial dos frutos.Item Edição gênica de cafeeiro via CRISPR-Cas9: clonagem de sgRNAS de genes da biossíntese da cafeína(Embrapa Café, 2019-10) Oliveira, Fernanda Freitas de; Aryioshi, Caroline; Girotto, Larissa; Santos, Tiago Benedito dos; Tomaz, Juarez Pires; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO café descafeinado apresenta uma demanda crescente do mercado consumidor, sendo portanto uma alternativa para produtores e indústria. Uma das alternativas de produção de cafés descafeinados é o silenciamento gênico via CRISPR-Cas9. O CRISPR-Cas9 é uma das ferramentas mais potentes e precisas de edição gênica, que consiste na utilização de um RNA guia (sgRNA) e de uma proteína Cas9 que reconhece regiões homólogas ao sgRNA e cliva o DNA, possibilitando o silenciamento do gene alvo. Visando iniciar trabalhos para produção de plantas de café descafeinado, neste trabalho apresentamos a estratégia de clonagem e produção de vetores CRISPR-Cas9 com sgRNAs para os genes da biossíntese da cafeína CaMXMT e CaDXMT Os sgRNAS foram desenhados na plataforma CRISPRdirect ® utilizando o C. canephora como genoma de referência. Dos 276 sgRNAs de MXMT e 317 de DXMT, foram selecionados os com menor número de off-targets e posicionados próximos a região terminal do genes, sendo três sgRNAs de cada gene: sgMXMT 1 , sgMXMT 2 , sgMXMT 3 , sgDXMT 1 , sgDXMT 2 , sgDXMT 3 . Para validar se os sgRNAs possuíam homologia com o genoma de C. arabica, foi realizado blast com o software BioEdit ® . Foi possível analisar através do alinhamento que os três sgRNAs de CaMXMT alinharam-se nos cromossomos “I” dos subgenoma de C. canephora e que sgMXMT 1 e sgMXMT 3 alinharam-se também no cromossomo “I” do subgenoma de C. eugenioides. Já os sgRNAs desenhados para CaDXMT, todos se alinharam ao cromossomo “A” no subgenoma de C. canephora. Apesar de não haver alinhamento no subgenoma de C. eugenioides, houve alinhamento no Scaffold 405, que contém a região gênica de DXMT de C. eugenioides, não sendo então um off-target. Os sgRNAs sgMXMT 1 e sgDXMT 1 foram ligados nos vetores pHAtc e pBAtc através de eletroporação. Foram positivadas por PCR 4 colônias para a ligação pHAtc/sgMXMT 1 , 3 para pHAtc/sgDXMT 1 e 2 para pBAtc/sgMXMT 1 . As colônias positivas na PCR foram também validadas por sequenciamento e detectou-se a inserção correta dos sgRNAs na posição esperada.Item Adaptação de acessos de Coffea arabica provenientes de camarões em várias condições edafoclimáticas(Embrapa Café, 2015) Charmetant, Pierre; Perthuis, Bernard; Bedimo, Joseph Mouen; Manga, Amougou Mbarga; Guerra, Antonio Fernando; Bartholo, Gabriel Ferreira; Rocha, Omar Cruz; Leroy, Thierry; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Rodrigues, Gustavo Costa; Andrade, Alan Carvalho; Marraccini, PierreO objetivo desse trabalho foi caracterizar recursos genéticos de Coffea arabica - acessos selvagens e cultivares - oriundo da África visando sua utilização no melhoramento. Os acessos provenientes de Camarões têm dados acumulados de mais de 30 anos. Oito acessos foram introduzidos em 2010 na Guiana Francesa e no Brasil para experimentação. No Brasil, depois de um período de quarentena, foram plantados ensaios no centro Cerrados da Embrapa e no IAPAR, além da Guiana Francesa Analisamos dados de crescimento, de ramificação secundária, de adaptação fisiológica à seca, para escolher genitores de cruzamentos com cultivares locais. Híbridos F1 estão sendo avaliados para selecionar os com melhor adaptação à evolução das condições climáticas.Item Identificação e caracterização de genes relacionados à biossíntese de ácidos clorogênicos em Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2015) Ivamoto, Suzana Tiemi; Sakuray, Leonardo Murai; Santos, Tiago Benedito dos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO Brasil é o maior produtor e exportador de café no cenário mundial, além de ser o segundo maior mercado consumidor da bebida, atrás apenas dos Estados Unidos. Pesquisas estão em desenvolvimento para aumentar o conhecimento genético de cafeeiros relacionada com a qualidade do produto. A qualidade da bebida é diretamente influenciada pelos compostos químicos presentes no grão de café, como por exemplo, ácidos clorogênicos (CGAs) que são relacionados à adstringência da bebida. Visando uma maior compreensão dos mecanismos moleculares e genéticos associados a produção dos CGAs, os objetivos deste trabalho são: i) identificar dos genes da via de biossíntese dos CGAs; ii) caracterizar o perfil transcricional in silico para alguns genes candidatos. Neste estudo foi utilizada uma montagem de Novo do transcriptoma de C. arabica e os seus respectivos 65,480 unigenes obtidos através de RNA-Seq de folhas, flores e de persiperma de frutos em diferentes fases de desenvolvimento. Foram identificados 45 genes candidatos para a via de biossíntese dos CGAs, os quais incluem todos os principais genes descritos para esta rota metabólica (fenilalanina amonialiase, cinamato 4-hidroxilase, 4 couramato CoA ligase, 4-couramato 3-hidroxilase, hidroxicinamoil quinato transferase e cafeoil-CoA O-metilttransferase).Item Validação de marcadores ligados a resistência à ferrugem do cafeeiro (Hemileiavastatrix)(Embrapa Café, 2015) Oliveira, Fernanda Freitas de; Ariyoshi, Caroline; Ramos, Luis Carlos; Pereira, Luiz Filipe ProtasioA ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotróficoHimeleiavastatrix é uma das principais enfermidades do cafeeiro, causando queda precoce das folhas o que leva a diminuição e prejuízos na produção. O melhoramento genético de cafeeiros visando à obtenção de cultivares resistentes é lento e a utlização de marcadores moleculares relacionados a resistência pode acelerar esse processo. O objetivo do presente estudo foi detectar a presença de dois marcadores (M19 e M20)que flanqueiam o gene de resistência à ferrugem (raça II) em uma população originada de Hibrido de Timor, em 47 genótipos de cafeeiro advindos do cruzamento entre C. arabica cv. Bourbon Vermelho e C. canephora cv. Robusta enviadas pelo Instituto Agronômico de Campinas (IAC).Trinta das 47 amostras apresentaram amplificação do marcador M19.Para o marcador M20, das 47 amostras, 41 amplificaram a banda específica e todas as amostras apresentaram algum tipo de banda, não específicas para a região.De todas as amostras, apenas 3 amostras (25, 44 e 45) não apresentaram banda para ambos os marcadores. Asamostras 6, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 23, 24, 33, 34, 35, 43 não apresentaram o amplicon para o marcador M19 e as amostras 16, 19 e 26 não apresentaram amplicon para o marcador M20.Infelizmente, não foi possível correlacionar o resultado genotípico com a avaliação fenotípica de resistência à ferrugem. Os resultados demonstram a importância da caracterizaçãoe mapeamentode novos genes para resistência à ferrugem em cafeeiros em diferentes coleções e populações.Item Expressão gênica em larga escala de raizes de Coffea arabica L.(Embrapa Café, 2015) Santos, Tiago Benedito dos; Silva, Juliana Costa; Soares, João Danillo Moura; Baba, Viviane Yumi; Pereira, Luiz Filipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Domingues, Douglas SilvaA utilização de novas tecnologias de sequenciamento em larga escala (454-mRNAseq) é uma frente inovadora de estudos para a biotecnologia do cafeeiro, promovendo a identificação e caracterização de novos componentes genômicos de interesse. Mudas de cafeeiro foram mantidas sob supressão de fontes nitrogenadas e suas raízes foram utilizadas para construção de bibliotecas de cDNA, que foram sequenciados utilizando a plataforma GS-FLX Titanium da Roche. Foram gerados um total 809.517 reads, os quais geraram 34.654 contigs. Por meio dos transcritos gerados pelo mRNAseq de raiz espera-se identificar e caracterizar molecularmente os genes envolvidos no transporte e metabolismo de nitrogênio no cafeeiro.Item Validação de marcadores microssatélites e diversidade genética de genótipos de Coffea arabica provenientes da Etiópia(Embrapa Café, 2015) Silva, Bruna Silvestre Rodrigues da; Cação, Sandra Bellodi; Ferreira, Rafaelle Vecchia; Santos, Maria Aparecida; Ivamoto, Suzana Tiemi; Silva, Juliana Costa; Androcioli, Leonardo Godoy; Domingues, Douglas Silva; Leroy, Thierry; Charmetant, Pierre; Sera, Gustavo; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO café é uma valiosa commodity agrícola, sendo sua bebida uma das mais populares do mundo. Apesar do sucesso dos programas de melhoramento em Coffea arabica, o desenvolvimento de novas cultivares é demorado, podendo levar mais de 20 anos. Além disso, a estreita base genética de C. arabica pode dificultar a obtenção de cultivares resistentes a pragas e a doenças ou tolerantes a estresses abióticos. Os acessos selvagens de C. arabica geneticamente distantes das variedades cultivadas proporcionam novos alelos para enriquecer sua variabilidade genética. O objetivo deste trabalho foi validar marcadores moleculares do tipo SSR em um painel de 24 acessos de C. arabica da coleção da Etiópia, realizar um estudo da diversidade, estrutura e seleção de genótipos para futuros trabalhos de introgressão no melhoramento. Neste trabalho foram utilizados 58 marcadores microssatélites (SSR) obtidos de análises in silico a partir de dados de RNA-seq da cultivar Iapar 59 e de sequências de BACs de Hibrido de Timor 832/2, e 77 SSR obtidos de uma extensa revisão bibliográfica em C. arabica e/ou C. canephora. Dos 135 SSR utilizados, 122 resultaram em produtos de amplificação e 31 foram polimórficos no painel. Desses, 20 SSR foram altamente informativos com valores de PIC acima de 0,7, e sete são descritos pela primeira vez. Um total de 165 alelos foram obtidos com média de 5,3 alelos por loco. O estudo de diversidade e estrutura genética dos acessos separou os genótipos em três principais grupos. A utilização de marcadores SSR informativos assim como o estudo de diversidade e estrutura genética destes e dos demais acessos permitirá a criação de uma coleção nuclear, facilitando a conservação, acessibilidade e uso de recursos genéticos de cafeeiros da Etiópia.Item Identificação de novos acessos de Coffea arabica introduzidos na coleção da Etiópia do IAPAR(Embrapa Café, 2015) Ferreira, Rafaelle Vecchia; Andrade, Giselly Aparecida; Charmetant, Pierre; Leroy, Thierry; Domingues, Douglas Silva; Pereira, Luiz Filipe ProtasioMarcadores microssatélites foram utilizados na discriminação de novos acessos de Coffea arabica que foram introduzidos na coleção da Etiópia do IAPAR, provenientes de uma coleção similar na República de Camarões. Inicialmente 46 acessos de Camarões foram repassados para a Embrapa CPAC (Embrapa Cerrados – Planaltina-DF), onde ficaram em quarentena. Em seguida, estes acessos foram transferidos para o IAPAR, porém durante os processos de quarentena e transferência, alguns dos acessos foram misturados. Visando identificar corretamente os acessos e também validar os SSRs previamente identificados, todos os 46 acessos foram analisados em géis de poliacrilamida. Os 8 locos microssatélites utilizados geraram um total de 19 alelos, com uma média de 2,3 alelos por loco. A variação alélica foi de 2 a 3 alelos por loco. Para realizar as análises de divergência genética uma matriz de distância foi computada e utilizada para obter uma árvore (dendograma) de diversidade global. Observou-se 3 diferentes agrupamentos entre os acessos ET34, Java e ET19. A análise genotípica dos diferentes locos microssatélites indicou quais acessos corresponderiam corretamente a ET34, Java ou ET19, já que este último teve o papel de controle positivo. Os marcadores microssatélites foram eficientes para discriminar os acessos de C. arabica provenientes de Camarões e o número de locos utilizado (8) também foi suficiente para a separação entre os acessos com seus respectivos genótipos.Item Identificação e caracterização de microssatélites de Coffea arabica a partir de dados de sequenciamento de RNA e de BACs(Embrapa Café, 2013) Silva, Bruna Silvestre Rodrigues da; Cação, Sandra Bellodi; Ivamoto, Suzana Tiemi; Silva, Juliana Costa; Domingues, Douglas Silva; Pereira, Luiz Filipe ProtasioO café é uma das principais commodities agrícolas mundiais, sendo consumido regularmente por 40% de toda população. As espécies, Coffea arabica L. e Coffea canephora P. são as de maior importância respondendo por 65% e 35% da produção mundial, respectivamente. Em C. arabica, o desenvolvimento de novas cultivares é demorado, podendo levar mais de 20 anos para finalização dos trabalhos. Além disso, estreita base genética de C. arabica dificulta a obtenção de cultivares resistentes a várias pragas e doenças, assim como uma maior tolerância a estresses abióticos. A utilização de marcadores moleculares para análise da diversidade e seleção de genótipos representa uma importante ferramenta para auxiliar o melhoramento e tentar diminuir esses problemas. Neste trabalho foi realizada identificação e análise in silico de SSR’s a partir de dados de RNA-seq de Iapar 59 e de sequências de BACs de Hibrido de Timor 832/2 (CaHT). Para Iapar 59 foram analisados 77 contigs, encontrados 39 SSR’s e desenhados 21 pares de oligonucleotídeos. Para CaHT foram analisados também 77 contigs, encontrados 35 SSR’s e desenhados 29 pares de oligonucleotídeos. Os motivos com maior frequência foram di, tri e tetranucleotídeos, sendo (AT)n o motivo mais frequente entre os dois genótipos. Esta busca de sequências repetitivas é de grande importância para futura validação e aumento desses marcadores para estudos de diversidade genética, mapeamento, e associação com características agronômicas de interesse.
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