SPCB - Simpósio de Pesquisa dos Cafés do Brasil
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Resultados da Pesquisa
Item Transformação genética de Coffea canephora mediada por Agrobacterium tumefaciens com gene heterólogo de ACC-oxidase na orientação anti-senso(2003) Ribas, Alessandra Ferreira; Kobayashi, Adilson Kenji; Cação, Sandra Maria Bellodi; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Ayub, Ricardo Antônio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféO fitorregulador etileno está associado a vários eventos fisiológicos em plantas. Em frutos climatéricos, um aumento dramático na síntese de etileno promove os passos subseqüentes do amadurecimento. Uma das alternativas para obtenção de plantas com maturação uniforme é o controle da síntese do fitorregulador etileno, pode ser feito através da transformação genética de plantas com genes da sua rota metabólica em orientação anti-senso. A enzima ACC oxidase, que catabolisa o último passo da biossíntese deste fitoregulador, tem sido um dos alvos preferidos para inibição com genes anti-senso, com uma conseqüente redução na produção de etileno. O objetivo deste trabalho foi introduzir o gene da ACC-oxidase do melão em plantas de C. canephora P. via Agrobacterium tumefaciens, usando o herbicida glufosinato de amônio como agente seletivo. Explantes de C. canephora foram cultivados em meio para indução de embriogênese direta ED (1/4 macro e 1/ 2 dos micronutrientes do meio MS, vitaminas do meio B 5 , 30 g.L -1 de sacarose, 100 mg.L -1 de cisteína), suplementados com 5 mM de 2-iP por três semanas. Os explantes foram imersos em suspensão de Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo o plasmídio pIBI3 que contém os genes da fosfinotricina acetiltransferase (bar) e da ACC-oxidase do melão na orientação anti-senso. Os explantes foram submetidos à sonicação por 2 segundos, sendo em seguida transferidos para meio ED e co-cultivados por 4 dias a 24° C no escuro. Após este período, os explantes foram transferidos para meio ED fresco contendo 10 mM de glufosinato e 400 mg.L -1 de cefotaxima. Inicialmente, 87 explantes foram co-cultivados e produziram 18 calos embriogênicos resistentes ao glufosinato quatro meses após a infecção. Embriões transgênicos putativos foram transferidos para meio ED sem fitoreguladores para permitir germinação. As plântulas provenientes de cinco eventos independentes foram aclimatadas em casa-de-vegetação. A análise de PCR confirmou a presença de fragmentos amplificados do gene bar (516 pb) em 44 das 62 plantas analisadas. Em plantas controle (não transformadas) nenhuma amplificação foi observada. A análise de Southern blot foi conduzida para avaliar a integração do gene da ACC oxidase de melão em plantas de C. canephora P. Os resultados demonstraram a presença do transgene em todas as seis plantas analisadas. A dupla digestão com as enzimas de restrição EcoR I e Hind III, liberou um fragmento de aproximadamente 1200 pb que hibridizou com a sonda correspondente ao transgene. Plantas transformadas e plantas controle foram pulverizadas com 1% (v/v) de uma formulação comercial de herbicida (Finale, AgrEvo â ) contendo 20% de glufosinato de amônio. Plantas controle demonstraram os primeiros sintomas de intoxicação 48 h após a pulverização devido a acumulação de amônia nos tecidos, e uma semana após as plantas estavam totalmente necrosadas. Nas plantas transformadas nenhum sintoma foi observado. As plantas estão em fase de crescimento em casa-de-vegetação. A determinação da produção de etileno será realizada, através de cromatografia gasosa, quando as plantas iniciarem a frutificação.Item Identificação e caracterização de genes de poligalacturonase de Coffea arabica(2003) Cação, Sandra Maria Bellodi; Galvão, Rafaelo Marques; Pereira, Luiz Felipe Protasio; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféAs poligalacturonases (EC 3.2.1.15, PG) são responsáveis pela degradação dos ácidos poligalacturônicos da parede celular, contribuindo para desassociação celular. Durante a maturação dos frutos, as poligalacturonases estão envolvidas na solubilização e na despolimerização da pectina aumentando a maciez do fruto. As poligalacturonases também participam de outros processos fisiológicos onde ocorre a separação de células como a abscisão e deiscência, germinação do pólen, formação do tubo polínico e resposta a estresses bióticos. A caracterização de genes de poligalacturonases possibilitará um maior entendimento do padrão de expressão deste gene e do funcionamento da enzima, podendo ser o ponto de partida para aplicações quanto à qualidade do café. Portanto este trabalho tem como objetivo a identificação e caracterização de genes de poligalacturonase de Coffea arabica que, subseqüentemente, serão utilizados para experimentos de transformação genética visando o controle do amadurecimento de frutos. Oligonucleotídeos foram desenhados baseados no alinhamento de seqüências conservadas de genes da poligalacturonase do banco de dados GeneBank. A reação de PCR foi conduzida utilizando DNA total de C. arabica, os produtos amplificados foram eluídos do gel de agarose e clonados no vetor pCR â 2.1-TOPO utilizando o Kit de clonagem TOPO TA Cloning â (Invitrogen). Clones contendo um fragmento de 600pb foram selecionados para o seqüenciamento. As seqüências foram analisadas utilizando o programa BLASTN, apresentando homologia com as seqüências de poligalacturonase de Lycopersicon esculetum, Cucumis melo e Nicotiana tabacum. Alguns clones também apresentaram alta homologia a ESTs do banco de dados do Projeto Genoma Café (http://arara.lbi.ic.unicamp/café/). Atualmente, estão sendo realizadas análises de Southern blot para verificar o número de cópias nas principais espécies de Coffea e análise de Northern blot para verificar a expressão da poligalacturonase em diferentes tecidos e estádios de maturação de frutos.Item Relações genéticas entre cultivares elite de cafeeiro (Coffea arabica L.) por marcadores AFLP(2003) Nunes, Liliane Moreira; Crochemore, Maria Lúcia; Milach, Sandra C. K.; Oliveira, Andrielber da S.; Vieira, Luiz Gonzaga Esteves; Consórcio Brasileiro de Pesquisa e Desenvolvimento do CaféCerca de 70% da produção mundial de café é representada por Coffea arabica L., caracterizada por produzir bebida de melhor qualidade, o que a torna a mais importante espécie comercial de café. Constitui-se na única espécie autógama e tetraplóide do gênero Coffea (2n = 4x = 44), apresentando baixa diversidade genética atribuída, principalmente, a sua recente origem alotetraplóide e biologia da reprodução. Por esta razão, a identificação dos cultivares de C. arabica tem sido dificultada, pois os descritores agronômicos e morfológicos, na maioria das vezes, não se mostram eficientes para diferenciá-los. Além disso, a avaliação destes caracteres requer muito tempo e mão-de-obra para a seleção de genótipos superiores em trabalhos de melhoramento. Neste trabalho, foi investigada a utilidade de marcadores AFLP para identificar polimorfismos em uma amostra de 22 cultivares elite de C. arabica, com o objetivo de determinar o nível de polimorfismo existente, a confiabilidade dos dados obtidos por AFLP e a capacidade dos marcadores polimórficos encontrados para discriminar esses genótipos. Para a análise da distância genética entre os materiais foi utilizado o coeficiente de similaridade de Sokal & Michener, sendo os índices de similaridade calculados com base na presença (1) e ausência (0) de bandas entre pares de genótipos. Para obter as classificações hierárquicas (dendrogramas) da matriz de similaridade foi utilizado o método de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair Group Mathematical Average). A utilização de apenas cinco combinações de primers permitiu a observação de 190 bandas, sendo 32% polimórficas. Os índices de similaridade obtidos variaram de 0,43 a 0,96, com uma média de 0,76. A estruturação obtida permitiu situar os cultivares dentro de grupos, ainda que algumas divergências tenham sido encontradas entre as relações de parentesco dos cultivares elite de C. arabica observada dentro desses grupos e suas origens genéticas. Desta forma, se faz necessária a obtenção de mais marcadores para a confirmação e elucidação dos dados obtidos até o momento.