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Item Clonagem e caracterização de um novo gene putativo de resistência do cafeeiro a Hemileia vastatrix e aplicação na seleção assistida(Universidade Federal de Viçosa, 2019-03-11) Almeida, Dênia Pires de; Caixeta, Eveline Teixeira; Zambolim, LaércioA ferrugem do cafeeiro, causada pelo fungo Hemileia vastatrix, é uma das doenças mais preocupantes para a cafeicultura mundial. A alta variabilidade genética desse fungo e, consequentemente, o surgimento de novas raças do patógeno, tem resultado na suplantação da resistência de cultivares lançadas pelos programas de melhoramento genético. Para desenvolver cultivares com resistência durável, é essencial o entendimento dos genes de resistência envolvidos e seus mecanismos moleculares de atuação na resistência. Dessa forma, nesse estudo, foi realizada a clonagem e caracterização molecular de um novo gene (Receptor Like Kinase) presente no Híbrido de Timor (HdT) CIFC 832/2, uma das principais fontes de resistência dos programas de melhoramento. A clonagem foi realizada a partir de screening de uma biblioteca de clones BAC (Bacterial Artificial Chromosomes), usando um gene que foi selecionado de biblioteca subtrativa entre interação compatível e incompatível de Cafeeiro-H. vastatrix. A sequência da BAC selecionada foi analisada, sendo identificado dois genes putativo para resistência do cafeeiro. Por meio de RT-qPCR, um dos genes, denominado de HdT_LRR_RLK2 (Leucine-rich repeat rececptor like kinase), apresentou pico de expressão apenas na interação incompatível, sendo esse considerado um novo gene putativo de resistência do cafeeiro a H. vastatrix. A partir desse gene caracterizado, foi desenvolvido um marcador molecular funcional, o qual foi analisado e validado em um conjunto de clones de cafeeiros diferenciadores de raças de H. vastatrix e, então, usados na seleção assistida (SAM). Na SAM, cafeeiros em diferentes gerações de melhoramento foram analisados com o marcador funcional desenvolvido, além de outros marcadores previamente obtidos e associados a diferentes genes de resistência a H. vastatrix. Foi utilizado marcadores SCAR, CAPS e SSR flanqueando dois locos (genes maiores) de resistência a raças I, II e patótipo 001 de H. vastatrix, previamente localizados em mapa genético, além de marcador funcional originado de outro gene clonado (CC-NBS-LRR) alocado em outra região do mapa genético. Nesse trabalho, também foram usados os marcadores CBD-Sat207 e CBD-Sat235 associados ao gene Ck1 de resistência a Coffee Berry Disease (CBD). Essa doença se encontra presente somente no continente africano, no entanto, o uso dos marcadores permite realizar melhoramento preventivo para essa importante doença. Nas gerações F 2 , F 3 e Retrocruzamento Suscetível (RCS 2 ) (Híbrido de Timor UFV 443-03 x Catuaí Amarelo IAC 64), as plantas foram genotipadas e fenotipadas com a raça II de H. vastatrix, para validação dos marcadores. As populações F 3:4 e RCS 3 foram genotipados com os marcadores validados. Foram identificados na F 3:4 cafeeiros com o genótipo AABBCCDDEe e no RCS 3 , genótipo AaBbCcD_E_, sendo que o loco A, B, C e D correspondem aos quatro locos de resistência a H. vastatrix e E ao loco de resistência a CBD. A SAM permitu a identificação e obtenção de piramidação de múltiplos genes de resistência a ferrugem e a CBD. Os genótipos identificados serão usados para avanço de geração e plantados para os testes de campo. O uso das estratégias de SAM e piramidação de genes têm potencial de obtenção de resistência duradoura à doenças, além de reduzir tempo, espaço e custo dos testes de campo, por permitirem o descarte de plantas contendo os alelos recessivos nos diferentes locos.Item Receptor-Like Kinase (RLK) as a candidate gene conferring resistance to Hemileia vastatrix in coffee(Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", 2021) Almeida, Dênia Pires de; Castro, Isabel Samila Lima; Mendes, Tiago Antônio de Oliveira; Alves, Danúbia Rodrigues; Barka, Geleta Dugassa; Barreiros, Pedro Ricardo Rossi Marques; Zambolim, Laércio; Sakiyama, Ney Sussumu; Caixeta, Eveline TeixeiraThe biotrophic fungus Hemileia vastatrix causes coffee leaf rust (CLR), one of the most devastating diseases in Coffea arabica. Coffee, like other plants, has developed effective mechanisms to recognize and respond to infections caused by pathogens. Plant resistance gene analogs (RGAs) have been identified in certain plants as candidates for resistance (R) genes or membrane receptors that activate the R genes. The RGAs identified in different plants possess conserved domains that play specific roles in the fight against pathogens. Despite the importance of RGAs, in coffee plants these genes and other molecular mechanisms of disease resistance are still unknown. This study aimed to sequence and characterize candidate genes from coffee plants with the potential for involvement in resistance to H. vastatrix. Sequencing was performed based on a library of bacterial artificial chromosomes (BAC) of the coffee clone ‘Híbrido de Timor’ (HdT) CIFC 832/2 and screened using a functional marker. Two RGAs, HdT_ LRR_RLK1 and HdT_LRR_RLK2, containing the motif of leucine-rich repeat-like kinase (LRR-RLK) were identified. Based on the presence or absence of the HdT_LRR_RLK2 RGA in a number of differential coffee clones containing different combinations of the rust resistance gene, these RGAs did not correspond to any resistance gene already characterized (SH1-9). These genes were also analyzed using qPCR and demonstrated a major expression peak at 24 h after inoculation in both the compatible and incompatible interactions between coffee and H. vastatrix. These results are valuable information for breeding programs aimed at developing CLR-resistant cultivars, in addition to enabling a better understanding of the interactions between coffee and H. vastatrix.Item Genomic prediction of leaf rust resistance to Arabica coffee using machine learning algorithms(Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz", 2021) Sousa, Ithalo Coelho de; Nascimento, Moysés; Silva, Gabi Nunes; Nascimento, Ana Carolina Campana; Cruz, Cosme Damião; Silva, Fabyano Fonseca e; Almeida, Dênia Pires de; Pestana, Kátia Nogueira; Azevedo, Camila Ferreira; Zambolim, Laércio; Caixeta, Eveline TeixeiraGenomic selection (GS) emphasizes the simultaneous prediction of the genetic effects of thousands of scattered markers over the genome. Several statistical methodologies have been used in GS for the prediction of genetic merit. In general, such methodologies require certain assumptions about the data, such as the normality of the distribution of phenotypic values. To circumvent the non-normality of phenotypic values, the literature suggests the use of Bayesian Generalized Linear Regression (GBLASSO). Another alternative is the models based on machine learning, represented by methodologies such as Artificial Neural Networks (ANN), Decision Trees (DT) and related possible refinements such as Bagging, Random Forest and Boosting. This study aimed to use DT and its refinements for predicting resistance to orange rust in Arabica coffee. Additionally, DT and its refinements were used to identify the importance of markers related to the characteristic of interest. The results were compared with those from GBLASSO and ANN. Data on coffee rust resistance of 245 Arabica coffee plants genotyped for 137 markers were used. The DT refinements presented equal or inferior values of Apparent Error Rate compared to those obtained by DT, GBLASSO, and ANN. Moreover, DT refinements were able to identify important markers for the characteristic of interest. Out of 14 of the most important markers analyzed in each methodology, 9.3 markers on average were in regions of quantitative trait loci (QTLs) related to resistance to disease listed in the literature.Item Artificial neural networks compared with Bayesian generalized linear regression for leaf rust resistance prediction in Arabica coffee(Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Embrapa, 2017-03) Silva, Gabi Nunes; Nascimento, Moysés; Sant’Anna, Isabela de Castro; Cruz, Cosme Damião; Caixeta, Eveline Teixeira; Carneiro, Pedro Crescêncio Souza; Rosado, Renato Domiciano Silva; Pestana, Kátia Nogueira; Almeida, Dênia Pires de; Oliveira, Marciane da SilvaThe objective of this work was to evaluate the use of artificial neural networks in comparison with Bayesian generalized linear regression to predict leaf rust resistance in Arabica coffee (Coffea arabica). This study used 245 individuals of a F 2 population derived from the self-fertilization of the F 1 H511-1 hybrid, resulting from a crossing between the susceptible cultivar Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) and the resistant parent Híbrido de Timor (UFV 443-03). The 245 individuals were genotyped with 137 markers. Artificial neural networks and Bayesian generalized linear regression analyses were performed. The artificial neural networks were able to identify four important markers belonging to linkage groups that have been recently mapped, while the Bayesian generalized model identified only two markers belonging to these groups. Lower prediction error rates (1.60%) were observed for predicting leaf rust resistance in Arabica coffee when artificial neural networks were used instead of Bayesian generalized linear regression (2.4%). The results showed that artificial neural networks are a promising approach for predicting leaf rust resistance in Arabica coffee.Item Desenvolvimento e utilização de marcadores moleculares para seleção de cafeeiros resistentes a ferrugem(Universidade Federal de Viçosa, 2015-07-28) Almeida, Dênia Pires de; Caixeta, Eveline TeixeiraA ferrugem alaranjada causada pelo fungo biotrófico Hemileia vastatrix Berk. et Br. é considerada em todo o mundo uma séria doença do cafeeiro que tem causado vários prejuízos para a cafeicultura. O uso de fungicidas é o método mais empregado para o controle da doença, porém sua aplicação deve ser feita de forma racional, para não inviabilizar a cultura e agredir o meio ambiente. Na busca por cultivares resistentes, já foram identificados nove genes dominantes de resistência a H.vastatrix presentes em cafeeiros de diferentes espécies. Uma potencial estratégia para introgredir esses genes de resistência no cafeeiro é o uso de marcadores moleculares. Logo, objetivou-se com esse trabalho, converter marcadores AFLPs ligados a locos de resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix em marcador SCAR (Sequence Characterized Amplified Region) e avaliar a eficiência do uso desses marcadores e de um microssatélite previamente identificado na Seleção Assistida por Marcadores (SAM). Para isso, quatro combinações de primers AFLPs ligados à resistência do cafeeiro à raça I, II e ao patótipo 001 de H. vastatrix foram clonados e sequenciados. Os marcadores SCAR desenvolvidos foram denominados de SCAFs e, posteriormente, validados nos genitores resistente Híbrido de Timor UFV 443-03; genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) e em 247 indivíduos da população F 2 de mapeamento. Os dados foram codificados e analisados no programa GQMOL. Com as sequências dos SCARs foi feita uma busca local no banco de dados do genoma de referência de Coffea canephora utilizando a ferramenta BLAST, e-value de -27. A fim de identificar quais genes estão envolvidos nas regiões dos cromossomos onde os SCARs apresentaram maior similaridade, foi realizada uma busca local utilizando a ferramenta Gbrowse, e-value de -10. Para a realização da SAM foram genotipados o marcador SCAF2 validado e um marcador microssatélite SSR16 em indivíduos das populações F 3 e de retrocruzamentos suscetíveis . Na realização da fenotipagem dos 16 discos de folhas de 1,5 cm de diâmetro de cada planta dos genitores, da geração F 3 e dos retrocruzamentos foram inoculados com uredósporos da raça II. Após as inoculações, os discos foram colocados sobre uma tela de nylon e espuma, saturada com água e acondicionados no interior de um gerbox. Os gerbox contendo os discos de folhas, foram fechados e mantidos na ausência de luz durante 48 horas, a 22oC e, em seguida, transferidos para uma câmara sob condições controladas de temperatura de 22°C e 12 horas de luz. No momento em que os discos inoculados do genitor suscetível Catuaí Amarelo IAC 64 (UFV 2148-57) iniciou a esporulação, em torno dos 25 dias após a inoculação (dpi), foi iniciada a avaliação de resistência/suscetibilidade. Na validação dos marcadores SCARs apenas o marcador SCAF2 apresentou polimorfismo entre os cafeeiros resistentes e suscetíveis, se comportando como marcador dominante em repulsão. Os outros marcadores SCARs desenvolvidos não apresentaram polimorfismo entre os cafeeiros quando os fragmentos foram analisados em gel de agarose. Logo, somente o marcador SCAF2 foi validado mantendo o mesmo ordenamento no grupo de ligação 2 (GL2) do mapa genético de ligação, ficando ligado a 0 cM do AFLP que lhe deu origem. Na busca local no genoma de C. canephora encontrou-se maior similaridade dos marcadores SCAF1, SCAF2 com o cromossomo 0, chamado de ChrUn, e maior similaridade dos marcadores SCAF3 e SCAF4 com o cromossomo 10. Na identificação dos genes, os marcadores SCAF1 e SCAF2 pertencentes ao GL2 do mapa genético apresentaram similaridade com alguns genes que codificam proteínas relacionadas à resistência a patógenos. Na SAM, foi verificado que o uso dos marcadores moleculares permitiu selecionar indivíduos homozigotos dominantes para um dos locos e para os dois locos, sendo mais eficiente que a fenotipagem. Logo, com o desenvolvimento de marcadores SCAR e SSR16 intimamente ligados aos locos de resistência à ferrugem do cafeeiro e seu uso na SAM possibilitaram um avanço nos programas de melhoramento com a seleção precoce de indivíduos e também uma posterior clonagem posicional de genes ligados à resistência a essa doença.