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Item Análise funcional da região promotora de haplótipos do gene CcDREB1D de Coffea canephora via transformação genética de Nicotiana tacabum cv. SRI(Universidade Federal de Lavras, 2014-02-28) Aquino, Sinara Oliveira de; Marraccini, Pierre RogerEstudos recentes resultaram na identificação de vários genes candidatos para tolerância à seca que apresentaram expressão diferencial contrastante entre genótipos. Dentre esses, encontram-se genes integrantes da via de resposta ao estresse hídrico, tais como os fatores de transcrição DREB. Resultados da expressão do gene CcDREB1D nas folhas dos clones 14 (tolerante) e 22 (sensível) de Coffea canephora Conilon mostraram uma maior expressão desse gene em condição de défice hídrico no clone 14 comparado ao clone 22. Após sequenciamento, polimorfismos na região promotora do gene CcDREB1D, que podem indicar a participação de três haplótipos (15, 16 e 17) no controle genético da tolerância à seca, foram identificados nos clones 14 e 22. Visando estudar a participação dos polimorfismos na resposta à seca, várias construções gênicas, com diferentes fragmentos da região promotora do gene CcDREB1D, foram arquitetadas no vetor binário pBI101 e testadas via transformação genética de Nicotiana tabacum cv. SRI, a fim de avaliar a capacidade dos fragmentos de controlarem a expressão do gene repórter β-glucuronidase (uidA). Testes histoquímicos indicaram uma forte atividade GUS (forte coloração) correspondente ao controle positivo (pBI121) enquanto que nenhuma atividade GUS foi detectada para o controle negativo (pBI101). Tanto nas folhas, como nas raízes, uma expressão basal do gene uidA foi verificada nas plantas T0 sem estresse, sobretudo para as construções contendo as versões mais longas (D) do pDREB1D. Para verificar se a região promotora dos haplótipos do gene CcDREB1D responderiam aos estresses abióticos, as plantas transformadas de tabaco foram submetidas a ensaios de desidratação e de temperatura elevada e a expressão do gene repórter uidA foi analisada por testes histoquímicos GUS e PCR quantitativa em tempo real (qPCR). Experimentos de qPCR confirmaram uma leve indução do gene uidA nas folhas das plantas T0 transformadas com pD22-hp17D. No entanto, os níveis de expressão deste gene foram muito inferiores aos das plantas transformadas com o controle positivo (pBI121). Nenhuma indução do gene repórter foi observada nas plantas transformadas com as diferentes construções contendo os outros haplótipos (15 e 16) do promotor CcDREB1D. Contudo, esses resultados mostraram que (1) os promotores pDREB1D de C. canephora são fracos em tabaco, (2) o promotor do haplótipo 17 oriundo do clone 22 de C. canephora é induzido com estresses abióticos nas folhas de tabaco, mostrando que os mecanismos moleculares implicados na regulação da expressão gênica em resposta à seca são (pelo menos parcialmente) conservados entre cafeeiro e tabaco, e que (3) o funcionamento dos promotores pDREB1D dos clones 14 e 22 de cafeeiro é diferencial em tabaco, sugerindo que os polimorfismos identificados nesses promotores participam da regulação destas sequências.Item Estrutura e diversidade genética de uma população de Coffea canephora conilon utilizando marcadores SNPs identificados por nextRAD(Embrapa Café, 2015) Carneiro, Fernanda de Araújo; Rêgo, Érica Cristina Silva; Aquino, Sinara Oliveira de; Costa, Tatiana Santos; Lima, Edriana Araújo de; Rocha, Omar Cruz; Rodrigues, Gustavo Costa; Carvalho, Milene Alves de Figueiredo; Marraccini, Pierre; Bartholo, Gabriel Ferreira; Guerra, Antônio Fernando; Silva Jr, Orzenil Bonfim da; Grattapaglia, Dario; Andrade, Alan CarvalhoDentre as diferentes atividades ligadas ao negócio agrícola em nível mundial, o agronegócio cafeeiro está entre as de maior importância econômica e social, sendo o principal meio de subsistência para mais de 125 milhões de pessoas e produzido em mais de 60 países. A produção cafeeira comercial baseia-se principalmente em duas espécies: Coffea arabica e Coffea canephora. A grande variabilidade genética do C. canephora devido sua alogamia, é um fator de grande importância para os programas de melhoramento do cafeeiro, pois fornece uma fonte de novos genes. O estudo molecular da diversidade genética vem se demonstrando cada vez mais eficiente, necessário e refinado, uma vez que as técnicas moleculares estão evoluindo e os descritores morfológicos estão se tornando insuficientes para a descrição de um indivíduo. Uma ferramenta muito importante no estudo da diversidade genética é o uso dos marcadores moleculares SNPs (Single Nucleotide Polymorphism), estes consistem na variação de sequência de DNA e podem ser identificados em praticamente todos os genes. No caso de C. canephora, estudos de diversidade podem facilitar a orientação dos programas de melhoramento na escolha de genitores para cruzamentos ou de genótipos para composição de variedades clonais. Este trabalho objetivou (i) avaliar e caracterizar, por meio da técnica de genotipagem nextRAD (Nextera-tagmented reductively-amplified DNA), a diversidade e a estrutura genética de indivíduos de C. canephora Conilon, pertencentes a uma população localizada em campo experimental da Embrapa Cerrados.Item Estudo das famílias gênicas CcPYL, CcPP2C e CcSnRK2: componentes centrais na via aba-dependente para a resposta ao déficit hídrico em Coffea canephora(Embrapa Café, 2015) Cotta, Michelle Guitton; Bocs, Stéphanie; Rego, Erica Cristina Silva; Costa, Tatiana Santos; Aquino, Sinara Oliveira de; Carneiro, Fernanda De Araújo; This, Dominique; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan CarvalhoO déficit hídrico e altas temperaturas são consequências atuais e diretas do aquecimento global e fatores-chave que afetam o desenvolvimento e a produtividade cafeeira. Apesar das complexas estratégias utilizadas por plantas perenes para adaptarem-se à seca, existe no gênero Coffea variabilidade genética que pode ser utilizada como ferramenta para potencializar a tolerância das plantas a esse estresse. O Ácido abscísico (ABA) é o hormônio central que regula a fisiologia da planta na resposta ao déficit hídrico. O objetivo do presente trabalho foi identificar e caracterizar os genes componentes do sistema tripartite (PYL-PP2C-SnRK2) de percepção e transdução de sinal de ABA em Coffea canephora. Clones tolerantes (14, 73 e 120) de C. canephora Conilon têm sido caracterizados como plantas vigorosas com alta produtividade durante anos em regime de escassez hídrica e apresentam-se como valiosos modelos de estudo. Receptores intracelulares (PYR/PYL/RCAR) envolvidos na percepção do sinal de ABA foram recentemente identificados em plantas. Um mecanismo de transdução de sinal de ABA foi proposto, envolvendo tais receptores interagindo com fosfatases do tipo PP2C e quinases SnRK2. Neste trabalho, as sequências proteicas de Arabidopsis, citros, arroz, uva, tomate foram escolhidos como query para a busca das respectivas sequências ortólogas de café em bancos de dados. Essa abordagem permitiu identificar 24 genes candidatos (9 PYL/RCAR, 6 PP2Cs e 9 SnRK2) no genoma de C. canephora. Os domínios protéicos específicos de cada família gênica foram verificados nas sequencias aminoacídicas preditas o que permitiu caracterizá-las como receptores (PYR/PYL/RCAR), fosfatases (PP2C) ou quinases (SnRK2) da via de sinalização de ABA. Análises filogenéticas permitiram classificar as sequências polipeptídicas nas subclasses e subfamílias esperadas. As estruturas gênicas (éxons, íntrons e UTRs) foram funcionalmente anotadas no genoma de C. canephora (Coffea Genome Hub: http://coffee-genome.org/). Expressão diferencial foi observada in silico para esses genes nos órgãos (folha, semente, raiz e órgãos florais) de C. canephora. Em condições de déficit hídrico, dados de transcriptoma de raiz mostraram diferentes perfis de expressão entre os clones tolerantes (14, 73 e 120) e o sensível (22). Os resultados de qPCR evidenciaram perfis transcriptômicos diferenciais inclusive entre os clones tolerantes sugerindo a existência de múltiplos mecanismos biológicos para a tolerância à seca por meio da via dependente de ABA no cafeeiro. Outros resultados enfatizaram mecanismos comuns de indução gênica para todos os clones na condição não-irrigada. Tais informações podem ser úteis na identificação do determinismo genético da tolerância à seca no cafeeiro e para obtenção de marcadores moleculares visando auxiliar programas de melhoramento.Item Análise de promotores do gene CcDREB1D de Coffea canephora via transformação genética de Nicotiana tabacum(Embrapa Café, 2015) Aquino, Sinara Oliveira de; Carneiro, Fernanda de Araújo; Rêgo, Érica Cristina Silva; Duarte, Karoline Estefani; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Andrade, Alan Carvalho; Marraccini, PierreApós sequenciamento, polimorfismos na região promotora do gene DREB1D (Dehydration Responsive Element Binding Protein) de Coffea canephora Conilon, indicaram a participação de três haplótipos (15, 16 e 17) no controle genético da tolerância à seca nos clones 14 (tolerante a seca) e 22 (sensível a seca), com as combinações de haplótipos 15-16 para o clone 14 e 15-17 para o clone 22. A fim de avaliar a capacidade desses fragmentos controlarem a expressão do gene repórter uidA, 3 construções gênicas, com os diferentes haplótipos do promotor do gene CcDREB1D, foram feitas no vetor binário pBI101 e testadas independentemente via transformação genética de Nicotiana tabacum. Testes histoquímicos em plantas transformadas de N. tabacum T1 indicaram uma forte atividade GUS correspondente ao controle positivo (pBI121) enquanto nenhuma atividade foi detectada para o controle negativo (WT). Os resultados mostraram que, mesmo fracos, os promotores pDREB1D de C. canephora são funcionais em tabaco (N. tabacum), se comportando de forma diferencial entre os haplótipos, sugerindo que os polimorfismos identificados neles são essências na regulação destas sequências.Item Análise funcional da região promotora do gene CcDREB1D de dois genótipos de Coffea canephora por meio da transformação genética de Nicotiana tabacum(Embrapa Café, 2013) Aquino, Sinara Oliveira de; Duarte, Karoline Estefani; Alves, Gabriel Sérgio Costa; Marraccini, Pierre; Andrade, Alan CarvalhoApesar de alguns estudos em fisiologia vegetal resultarem em uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na tolerância à seca em cafeeiro, ainda é escasso o conhecimento acerca das alterações metabólicas e moleculares envolvidas na resposta às condições de déficit hídrico nesta espécie. Neste sentido, estudos recentes permitiram a identificação de vários genes candidatos que apresentaram expressão diferencial entre genótipos contrastantes para essa característica. Dentre esses, encontram-se genes integrantes da via de resposta ao estresse hídrico, previamente identificados em outras espécies vegetais, tais como os fatores de transcrição DREB. Resultados prévios obtidos, analisando a expressão relativa do gene CcDREB1D nos clones 14 (tolerante à seca) e 22 (sensível à seca) de Coffea canephora var. Conilon demonstraram expressão diferencial desse gene em folhas de plantas submetidas ou não a seca. Polimorfismos na região promotora do gene CcDREB1D foram também identificados e podem indicar a participação de diferentes haplótipos no controle genético da tolerância à seca. Várias deleções 5’ da região promotora do gene CcDREB1D foram feitas e clonadas no vetor binário pBI101 como objetivo de analisar o papel dos polimorfismos identificados no promotor do gene CcDREB1D na expressão do gene repórter uidA codificando para a β-glucuronidase por meio da transformação genética de Nicotiana tabacum.