Biblioteca do Café
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Resultados da Pesquisa
Item Padronização de metodologia para mensuramento do conteúdo de DNA de cada cromossomo de Coffea canephora via citometria de imagem(2007) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Fontes, Marcelo Antoniol; Embrapa - CaféO Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor do grão. Parte desse aumento tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citométricos, os quais geram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entres os vários níveis de contribuição, a citometria de imagem, metodologia que mensura o conteúdo relativo e/ou absoluto de DNA por meio do cálculo da densidade óptica integrada (DOI) de núcleos ou cromossomos corados com reativo de Schiff, fornece informações úteis para o planejamento de projetos de seqüenciamento e estabelecimento de mapas genéticos. O objetivo do presente estudo foi estimar o conteúdo de DNA, em picogramas, para cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã via citometria de imagem. Suspensões de agregados celulares foram tratadas com amiprofos-metil, fixadas e maceradas enzimaticamente. As técnicas de dissociação celular e secagem ao ar foram empregadas no preparo das lâminas, e essas foram hidrolisadas e coradas com reativo de Schiff. As imagens cromossômicas foram capturadas, por meio de microscópio e câmera CCD, e analisadas com recursos digitais de análise de imagem. Os procedimentos metodológicos proporcionaram prometáfases e metáfases contendo cromossomos morfologicamente preservados. Dentre essas imagens mitóticas, foram selecionadas três prometáfases e seis metáfases com cromossomos sem sobreposições e no mesmo plano de foco, estas foram utilizadas na montagem dos cariogramas e no cálculo da DOI. A partir dos valores médios de DOI dos cromossomos e do conteúdo 2C de DNA de C. canephora cv. Apoatã (1,43 pg) foi mensurado o conteúdo de DNA para cada cromossomo, que variou de 0,18 pg (cromossomo 1) a 0,10 pg (cromossomo 11). Os resultados abrangem informações acerca do genoma desta espécie que podem ser úteis em programas de melhoramento, seqüenciamento e em estudos evolutivos.Item Análise morfométrica dos cromossomos de Coffea congensis obtidos de suspensões de agregados celulares(2005) Clarindo, Wellington Ronildo; Fontes, Marcelo Antoniol; Cruz, Ana Claudia Ferreira da; Carvalho, Carlos Roberto de; Embrapa - CaféO Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor desse grão. Parte do aumento da produção tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citogenéticos, os quais procuram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entre os diversos níveis de contribuição, essa linha de pesquisa tem forte potencial como ferramenta de prospecção e monitoramento de genomas, considerando-se que a caracterização dos cariótipos gera informações que se estendem da cultura de tecidos a processos de hibridação. Citogeneticamente procurou-se obter cromossomos com morfologia adequada para caracterização de C. congensis, com aplicação de metodologias que aumentam o índice metafásico e fornecem cromossomos com morfologia mais adequada para caracterização e montagem de cariogramas. O complemento de C. congensis corresponde a 2x=22 cromossomos, sendo quatro metacêntricos (4, 6, 8 e 9) e sete submetacêntricos (1, 2, 3, 5, 7, 10 e 11). A constrição secundária foi identificada na porção distal do braço curto do cromossomo 7. Com este estudo, espera-se que os resultados descritos representem um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.Item Utilização de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem para caracterização do genoma de Coffea canephora e C. arabica(Universidade Federal de Viçosa, 2008) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Universidade Federal de ViçosaA aplicação de técnicas citogenéticas, de citometria de fluxo e de imagem tem possibilitado a caracterização do genoma de Coffea arabica L. e Coffea canephora Pierre ex Froehner. Esses trabalhos vêm provendo relevantes informações a estudos evolutivos e para o melhoramento da cultura. Levando em conta a necessidade de ampliação das informações acerca do genoma de C. arabica e C. canephora, esse estudo aprimorou estratégias citogenéticas e citométricas para gerar novos dados acerca do genoma dessas espécies. Inicialmente, metodologias citogenéticas aplicadas em suspensões de agregados celulares de C. canephora geraram cromossomos com morfologia adequada para caracterização morfométrica e montagem do cariograma da espécie. A aplicação das técnicas de bandeamento Ag-NOR e Hsc-FA possibilitaram a identificação da NOR ativa no braço curto do cromossomo 6. Após empregar os mesmos procedimentos utilizados para C. canephora em agregados celulares de C. arabica, foram obtidos cromossomos metafásicos e prometafásicos apresentando resolução suficiente para realização das análises citogenéticas e para montagem do cariograma da espécie. As análises morfométricas evidenciaram tanto cromossomos morfologicamente idênticos quanto diferentes, sugerindo que C. arabica é um alotetraplóide, não segmental, formado a partir do cruzamento de duas espécies com genoma similar. A citometria de fluxo foi empregada para mensurar o conteúdo de DNA nuclear e determinar a composição de bases de C. canephora e C. arabica. Análises preliminares mostraram que os procedimentos envolvendo o uso dos tampões OTTO e de compostos antioxidantes resultaram histogramas apresentando picos de núcleos em G0/G1 com coeficientes de variação considerados adequados para análises citométricas. Além disso, foi demonstrado que, em comparação com Pisum sativum e Raphanus sativus, Solanum lycopersicum foi a planta utilizada como padrão de DNA conhecido que gerou as estimativas mais acuradas acerca do conteúdo de DNA nuclear de C. arabica e C. canephora. Numa segunda etapa foi verificado que o tamanho médio do genoma nuclear de C. arabica (2,62 picogramas) e C. canephora (1,41 picogramas) obtido por meio do fluorocromo iodeto de propídeo foi idêntico ao mensurado com núcleos corados com SYBR Green I. Entretanto, o corante SYBR Green I proporcionou análises citométricas mais precisas, visto que os picos gerados por núcleos na fase G0/G1 apresentaram coeficientes de variação abaixo dos obtidos com iodeto. Além do conteúdo absoluto de DNA, a composição de bases também foi mensurada para as duas espécies utilizando núcleos corados com 4’,6’-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e cromomicina A3 (CMA3). C. arabica apresentou um percentual de bases AT equivalente a 63,04% e GC 36,96%, enquanto o percentual de base AT de C. canephora foi 65,27% e GC 34,73%. A associação de metodologias citogenéticas e citométricas de fluxo e imagem permitiu estimar o conteúdo de DNA de cada cromossomo de C. arabica e C. canephora. Os resultados obtidos também mostraram que C. arabica é um verdadeiro allotetraplóide e geraram evidências que C. canephora é um possível progenitor dessa espécie. Os dados apresentados forneceram novas informações acerca das características, composição e organização do genoma de C. arabica e C. canephora e representam um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.Item Avaliação de agregados celulares de café (Coffea spp.) por técnicas citométricas e citogenéticas(Universidade Federal de Viçosa, 2004) Clarindo, Wellington Ronildo; Carvalho, Carlos Roberto de; Universidade Federal de ViçosaO Brasil lidera o mercado mundial de café em produção e exportação e é o segundo maior consumidor desse grão. Parte do aumento da produção tem sido atribuída aos investimentos em programas de melhoramento e às inovações geradas pelos processos biotecnológicos. Espécies do gênero Coffea têm sido objetos de estudos citogenéticos e citométricos, os quais procuram dados de base citológica e genética para contribuir com programas de melhoramento. Entre os diversos níveis de contribuição, essa linha de pesquisa tem forte potencial como ferramenta de prospecção e monitoramento de genomas, considerando-se que a caracterização dos cariótipos e a quantificação do conteúdo genômico geram dados que se estendem da cultura de tecidos a processos de hibridação. Levando em conta a necessidade de aprimoramento de estratégias de pesquisas citogenética e citométrica, desenvolveram-se quatro ferramentas de estudo em Coffea. Citogeneticamente, procurou-se obter cromossomos com morfologia adequada para caracterização de C. congensis, com aplicação de metodologias que aumentam o índice metafásico e fornecem cromossomos com morfologia mais adequada para caracterização e montagem de cariogramas. O complemento de C. congensis corresponde a 2x=22 cromossomos, sendo quatro metacêntricos (4, 6, 8 e 9) e sete submetacêntricos (1, 2, 3, 5, 7, 10 e 11). A constrição secundária foi identificada na porção distal do braço curto do cromossomo 7. A citometria de imagem foi utilizada para estimar o conteúdo de DNA em picogramas (pg) de cada cromossomo de C. canephora cv. Apoatã. Neste estudo foi possível mensurar, a partir da densidade óptica, o conteúdo de DNA, com 2C=1,43 pg, dos 11 cromossomos. Os valores encontrados variaram entre 0,18 pg (cromossomo 1) e 0,10 pg (cromossomos 10 e 11). Amostras de calos e agregados celulares de C. canephora cv. Apoatã foram coletadas para verificar se há relação entre os núcleos interfásicos com diferente número e o tempo de manutenção das culturas nas condições in vitro. A partir dos valores percentuais de células com um, dois, três ou quatro nucléolos, foi aplicada a análise de regressão, que indicou que o tempo das culturas in vitro altera o número de nucléolos por núcleo, o que pode ser utilizado como ferramenta no monitoramento de ocorrências de variações somaclonais. Em termos de citometria de fluxo, analisaram-se suspensões nucleares extraídas de agregados celulares fixados de C. arabica cv. Catuaí Vermelho e corados com DAPI. Os histogramas gerados evidenciaram a ocorrência de variação somaclonal (aneuploidias e euploidias) ao longo dos subcultivos das suspensões de agregados celulares com células em diferentes fases do ciclo celular. Com este estudo, espera-se que os resultados descritos representem um avanço na prospecção do genoma do cafeeiro.